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与中国原产完全甜柿乙醇脱涩相关基因的筛选

作　者: 杨福勇
导　师: 罗正荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 中国原产完全甜柿乙醇脱涩处理抑制消减杂交表达序列标签
分类号: S665.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

中国原产完全甜柿(简称中国甜柿或C-PCNA)是在湖北省大别山区发现的完全甜柿种质资源,具有解决甜柿亲本稀少而造成的近交退化现象的应用潜力,但其遗传背景及脱涩机理尚不清楚。本研究以‘小果甜柿’(Diospyros kaki Thunb.’Xiaoguo-tianshi’)为试材,采用SSH(抑制消减杂交)技术筛选人工脱涩过程中差异表达基因,以期为探讨其脱涩机理及其遗传改良提供进一步的科学依据。主要研究结果如下：1.本试验构建10%乙醇处理果实的正反向消减文库；正向文库随机挑选和保存1600个阳性克隆,反向文库随机挑选和保存1800个阳性克隆。2.本试验利用抗生素和菌液PCR等方法筛选文库阳性克隆；菌液PCR分析表明,克隆插入片段在300-1200bp之问,文库重组率为95%；正向文库随机挑选34个阳性克隆测序获得32条有效EST序列,反向文库挑选59个阳性克隆测序获得55条有效EST序列；剔除重复序列和小于100bp序列,两库序列合并组装获得70条序列。利用BLAST进行非冗余(non-redundant)数据库序列相似性比对,其中53条序列有确切功能,根据其预测功能进行GO(gene ontology)分类,其生物学功能有：转运活性(transporter activity)2个、催化活性(catalytic activity)22个、结构分子活性(structural molecule activity)3个、分子传感器活性(molecular transducer activity)1个和绑定活性(binding activity)24个。3.正向文库获得8条与脱涩相关的EST序列,其中包括参与柿果实无氧条件下乙醇发酵代谢过程的两个关键酶—丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)基因序列；另外六个编码的蛋白分别为NADH泛醌氧化还原酶亚基7(nadh-plastoquinone oxidoreductase subunit7,NQO)、甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)、跨膜超家族9成员4(transmembrane9superfamily member4-like, TM9SF-4)、液泡巯基蛋白酶(thiol protease aleurain)、细胞色素B还原酶(cytochrome b reductase)和MYB转录因子(myb family transcription factor)。4.反向文库获得14条与脱涩相关的EST序列,编码的蛋白包括：S-腺苷甲硫氨酸合成酶(s-adenosylmethionine synthetase, SAMS); cop9信号小体复合体亚基5A(cop9signalosome complex subunit5a-like);ring-box蛋白(ring-box protein, RBX); cullin3蛋白(cullin3);组蛋白h3(histone h3):双因子响应调节阀arr11(two-component response regulator arr11);组织蛋白酶b(cathepsin b);过敏诱导响应蛋白(hypersensitive-induced response protein);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH);小分子热休克蛋白(small heat shock protein);核酮糖二磷酸羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain); cc-nbs-lrr抗性蛋白(cc-nbs-lrr resistance protein):蛋白-L-异天冬氨酸O-甲基转移酶(protein-L-isoaspartate o-methyltransferase)和kdaI类热休克蛋白(kda class i heat shock protein)。综上所述,中国甜柿的脱涩过程与参与‘凝固效应’的ADH和PDC有关,可能还包括转运等相关基因的表达。C-PCNA果实乙醇脱涩相关消减文库的构建为进一步研究打下了良好基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
1 前言  11-20
  1.1 课题的提出  11-12
  1.2 前人研究进展  12-19
    1.2.1 植物单宁研究概述  12-13
    1.2.2 柿单宁结构及组成研究进展  13-14
    1.2.3 柿单宁合成相关基因研究进展  14-16
    1.2.4 柿单宁凝固相关基因及脱涩机理研究进展  16-17
    1.2.5 抑制消减杂交技术研究概况  17-19
  1.3 本课题研究内容  19
  1.4 技术路线  19-20
2 材料与方法  20-33
  2.1 试验材料  20-21
    2.1.1 植物材料和菌种  20
    2.1.2 主要试剂  20
    2.1.3 主要仪器  20
    2.1.4 细菌培养基  20-21
  2.2 实验方法  21-33
    2.2.1 植物材料准备  21-22
    2.2.2 柿单宁含量测定  22
      2.2.2.1 溶性单宁含量测定  22
      2.2.2.2 不溶性单宁含量测定  22
    2.2.3 抑制消减杂交  22-30
      2.2.3.1 总RNA提取  22-24
      2.2.3.2 cDNA第一链合成  24
      2.2.3.3 cDNA第二链合成  24-25
      2.2.3.4 Rsa Ⅰ酶切  25-26
      2.2.3.5 接头连接  26-27
      2.2.3.6 接头连接效率检测  27
      2.2.3.7 第一次杂交  27-28
      2.2.3.8 第二次杂交  28
      2.2.3.9 第一轮PCR扩增  28-29
      2.2.3.10 第二轮PCR扩增  29-30
      2.2.3.11 利用actin引物检测消减效率  30
    2.2.4 消减文库的生成  30-33
      2.2.4.1 PCR扩增产物的纯化回收  30-31
      2.2.4.2 回收产物连接载体  31
      2.2.4.3 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备(CaCl_2法)  31
      2.2.4.4 转化  31-32
      2.2.4.5 消减文库质量分析  32
      2.2.4.6 阳性克隆的筛选  32-33
3 结果与分析  33-41
  3.1 果实单宁含量测定  33
  3.2 果实总RNA的提取  33-34
  3.3 消减文库的构建  34-41
    3.3.1 柿果实ds cDNA的扩增  34
    3.3.2 柿果实ds cDNA酶切前后的检测  34-35
    3.3.3 接头连接效率检测  35-36
    3.3.4 消减杂交后两次PCR的结果分析  36
    3.3.5 消减效率分析  36-37
    3.3.6 文库插入片段检测  37
    3.3.7 序列分析  37-41
4 讨论  41-49
  4.1 柿果实总RNA的提取  41-42
  4.2 抑制消减文库构建和文库质量  42-43
  4.3 柿果实脱涩相关基因  43-48
  4.4 进一步研究计划  48-49
参考文献  49-59
致谢  59

与中国原产完全甜柿乙醇脱涩相关基因的筛选

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