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巴西橡胶树HbPht1基因的克隆和磷胁迫下根部和叶片的SSH文库构建

作　者: 汤银辉
导　师: 陈守才
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 巴西橡胶树 磷转运蛋白 RT-PCR RACE 基因克隆 序列分析 原核表达 抑制消减杂交
分类号: S794.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


磷素是高等植物正常生长所必需的大量元素之一,主要由根系从土壤中获取。缺磷是限制橡胶产量一个重要因子,海南橡胶园土壤缺磷较为普遍。对橡胶树磷营养性状进行遗传改良是缓解磷资源缺乏,提高橡胶产量和磷肥利用效率的有效途径之一。在大多数植物中,磷吸收由低亲和力和高亲和力两个转运系统组成；磷缺乏时,高亲和力转运系统是植物根吸收磷的主要机制。目前,已经从番茄、拟南芥、水稻等高等植物中分离出高亲和力磷酸盐转运蛋白,但橡胶树磷酸盐转运蛋白基因克隆和功能的研究工作至今仍是空白。近年来,抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)已用于鉴定橡胶树差异表达基因,但未见利用该技术鉴定磷营养相关基因的报道。本研究首次克隆了橡胶树磷酸盐转运蛋白基因HbPhtl,并利用抑制消减杂交技术获得了部分磷胁迫相关的ESTs。研究结果如下：1利用RT-PCR和RACE方法,首次从橡胶树胶乳中克隆到一个磷酸盐转运蛋白基因,命名为HbPht1 (GenBank接受号为HM015901)。该基因全长cDNA为1804 bp开放阅读框长度为1611 bp,5’非翻译区长65 bp,3’非翻译区长128 bp。2 HbPht1最长ORF编码536个氨基酸的蛋白,预测分子质量和等电点分别为59KDa和8.766。多肽链的疏水性分析表明,HbPhtl具有12个疏水的跨膜区和高亲和力磷酸盐转运蛋白中保守的3个磷酸化作用位点：蛋白激酶C作用位点(T-A-R), N端糖基化部位(N-A-T-T)和酪蛋白激酶Ⅱ作用部位(S-L-E-E).3植物磷酸盐转运蛋白在序列上高度保守,HbPht1与其它植物磷酸盐转运蛋白的同源性在70%以上。进化分析表明HbPht1被分在Pht1家族中,与高大乔木杨树PtrPHT1-4的亲缘关系最近,属于高亲和磷转运蛋白。4在大肠杆菌中进行HbPht1的原核表达,成功构建重组质粒pET-HbPht1。5用低磷胁迫处理橡胶树幼苗的根、叶cDNA为driver,正常磷处理橡胶幼苗的根、叶cDNA为tester,通过抑制消减杂交技术构建了两个富集差异表达基因的正向SSHcDNA文库。同时,以正常磷处理橡胶幼苗的根、叶cDNA为driver,低磷胁迫处理橡胶树幼苗的根、叶cDNA为tester,构建了两个富集差异表达基因的反向SSH cDNA文库。从这四个SSH cDNA文库中筛选出部分磷营养相关基因。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 前言  10-30
  1 巴西橡胶树的生物学研究现状  10-14
    1.1 巴西橡胶树生物学背景及产胶机理  10-11
    1.2 巴西橡胶树的分子生物学研究现状  11-14
    1.3 巴西橡胶树基因工程研究进展  14
  2 植物磷吸收的分子机理研究进展  14-25
    2.1 根系构型及根系分泌物  15-16
    2.2 菌根与磷吸收  16-17
    2.3 磷胁迫条件特异性表达基因  17-19
    2.4 植物的Pi-Transporter  19-25
      2.4.1 磷酸盐的获得与转运  19-20
      2.4.2 磷酸盐转运蛋白的结构  20-21
      2.4.3 磷酸盐转运蛋白的分类及其功能  21-23
      2.4.4 植物磷转运蛋白基因的表达调控  23-25
  3 抑制消减杂交技术概况  25-28
    3.1 SSH技术的原理及步骤  25-26
    3.2 SSH技术在特殊诱导研究中的应用  26-27
    3.3 SSH技术在植物发育研究中的应用  27-28
  4 本研究的意义  28-29
  5 技术路线  29-30
第二章 HbPht基因的克隆及生物信息学分析  30-50
  1 材料与试剂  30
    1.1 植物材料  30
    1.2 质粒及菌种  30
    1.3 生化试剂  30
  2 方法与步骤  30-41
    2.1 RNA的提取  30-31
    2.2 总RNA中微量DNA的去除  31-32
    2.3 逆转录合成cDNA第一链  32
    2.4 HbPht保守区域的扩增  32-35
    2.5 3'cDNA末端扩增  35-37
    2.6 5'cDNA末端扩增  37-40
    2.7 HbPht全长的克隆  40-41
    2.8 HbPht基因的生物信息学分析  41
  3 结果与讨论  41-50
    3.1 RNA提取  41
    3.2 HbPht基因的克隆  41-45
    3.3 巴西橡胶树Pht基因的生物信息学分析  45-49
    3.4 讨论  49-50
第三章 HbPht1基因的原核表达分析  50-60
  1 材料与试剂  50
    1.1 材料、质粒、菌株  50
    1.2 工具酶和试剂  50
  2 方法步骤  50-56
    2.1 原核表达载体pET-HbPht1构建  50-52
    2.2 pET-HbPht1融合蛋白表达  52-53
    2.3 His-HbPht1融合蛋白电泳(SDS-PAGE)  53-56
  3 结果与讨论  56-60
    3.1 pET-HbPht1原核表达载体构建  56-57
    3.2 pET-HbPht1重组质粒酶切鉴定及测序鉴定  57
    3.3 pET-HbPht1原核表达菌斑PCR鉴定  57-58
    3.4 pET-HbPht1原核表达及SDS-PAGE电泳分析  58-59
    3.5 讨论  59-60
第四章 橡胶树根、叶低磷胁迫处理抑制消减文库构建  60-75
  1 材料与试剂  60
    1.1 材料  60
    1.2 质粒及菌种  60
    1.3 生化试剂  60
  2 方法与步骤  60-69
    2.1 巴西橡胶树幼苗低磷胁迫处理  60-61
    2.2 巴西橡胶树幼苗根、叶总RNA提取  61-62
    2.3 抑制消减杂交  62-66
    2.4 PCR扩增  66-68
    2.5 克隆与鉴定  68-69
    2.6 ESTs功能注释  69
  3 结果与讨论  69-75
    3.1 各RNA的OD260测定结果及用量  69-70
    3.2 差减cDNA文库PCR扩增结果分析  70
    3.3 差减cDNA文库重组子的筛选  70-71
    3.4 cDNA克隆测序与序列分析  71-74
    3.5 讨论  74-75
第五章 论文小结  75-76
参考文献  76-87
附录  87-91
致谢  91

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 特用阔叶树类 > 橡胶树
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