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中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达cDNA文库的构建

作　者: 孙婧
导　师: 康现江
学　校: 河北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 中华绒螯蟹眼柄视上神经节肌肉抑制消减杂交(SSH) cDNA文库
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹,是一种食用风味独特,营养保健价值极高的重要经济水产品。但是,在河蟹养殖的过程中,蟹种性早熟的问题给生产带来了巨大的损失,严重制约着河蟹养殖业的发展。其性早熟可能与蟹体内的神经肽类激素分泌不正常有关。甲壳动物眼柄神经分泌细胞所分泌的激素在调控其生长发育过程中起着极其重要的作用。本研究的目的在于利用抑制消减杂交(SSH)技术构建中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA文库,为克隆眼柄视上神经节特异性表达的基因,研究这些基因的功能,探讨河蟹发育的分子机制,以及进一步阐明河蟹性早熟的分子机理奠定基础。本实验用Trizol法提取到了质量较好的中华绒螯蟹眼柄视上神经节和肌肉的总RNA,利用所得到的RNA成功进行反转录形成cDNA,经过RsaⅠ酶切后结果显示酶切比较充分,随后的接头连接效率检测也显示,Tester接头的连接效率大于30%,也满足后续实验要求(>25%)。两轮杂交和两次抑制PCR已经使看家基因Beta-actin被有效地消减下去,消减后看家基因的消减效率提高了215倍,使得眼柄视上神经节差异表达的基因得到了有效富集。两轮消减杂交后,初步构建了中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA文库。将纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌JM109,经抗性筛选方法对消减文库进行初步筛选,得到324个阳性克隆。随机挑取的PCR克隆产物结果显示：75%以上的克隆都能够扩增出有效的产物,PCR扩增片段主要集中在200bp-500bp(含接头序列42bp),构建的消减cDNA文库质量较好。挑选3组PCR产物呈阳性的菌液送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。BLAST比对结果显示：所得227bp序列没有找到与之相似的序列,但是否就是新基因还需要进一步的验证；所得到的309bp序列是河蟹蜕皮抑制激素的片段；所得到的438bp序列经比对后推测其为河蟹高血糖激素前体。说明用该方法构建眼柄视上神经节特异性表达的文库是可行的,并且按照该方法继续筛选阳性克隆,最终可以得到河蟹眼柄视上神经节特异性表达的基因。本研究利用SSH技术,成功构建了中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA消减文库,从而为进一步筛选想要得到的基因和发掘新基因提供素材。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-30
  1.1 甲壳动物内分泌系统的研究  12-18
    1.1.1 甲壳动物内分泌结构的研究  12-14
    1.1.2 甲壳动物眼柄激素的研究  14-17
      1.1.2.1 甲壳动物高血糖激素  15
      1.1.2.2 甲壳动物蜕皮抑制激素  15-16
      1.1.2.3 甲壳动物性腺抑制激素  16
      1.1.2.4 甲壳动物大颚器抑制激素  16-17
    1.1.3 中华绒螯蟹眼柄视上神经节结构的研究  17-18
  1.2 中华绒螯蟹性早熟机制的研究  18-22
    1.2.1 中华绒螯蟹性早熟的自身因素  19-20
    1.2.2 中华绒螯蟹性早熟的环境因素  20-21
    1.2.3 中华绒螯蟹性早熟的人为因素  21-22
  1.3 cDNA文库的构建方法  22-29
    1.3.1 差减cDNA文库  22-24
    1.3.2 全长cDNA文库  24-25
    1.3.3 其他构建文库的方法  25-26
    1.3.4 抑制消减杂交法(SSH)  26-29
  1.4 研究目的和意义  29-30
第二章实验材料与方法  30-45
  2.1 实验材料  30
  2.2 主要试剂  30
  2.3 主要实验仪器  30-31
  2.4 接头和引物序列  31-32
    2.4.1 cDNA synthesis Primer  31
    2.4.2 Adaptor 1/Adaptor 2R  31-32
    2.4.3 PCR Primer 1  32
    2.4.4 Nested PCR Primer 1/Nested PCR Primer 2R  32
    2.4.5 中华绒螯蟹看家基因Beta-actin序列  32
  2.5 实验方法  32-45
    2.5.1 中华绒螯蟹眼柄视上神经节和肌肉总RNA的提取  32-34
    2.5.2 cDNA的合成  34-35
      2.5.2.1 反转录cDNA第一链的合成  34
      2.5.2.2 cDNA第二链的合成  34-35
    2.5.3 Rsa Ⅰ酶切双链cDNA  35
    2.5.4 接头连接  35-36
    2.5.5 Tester cDNA接头连接效率检测  36-37
    2.5.6 杂交  37-39
      2.5.6.1 第一次杂交  37-38
      2.5.6.2 第二次杂交  38-39
    2.5.7 PCR扩增  39-40
      2.5.7.1 第一次PCR扩增  39-40
      2.5.7.2 第二次PCR扩增  40
    2.5.8 消减杂交效率检测  40-41
    2.5.9 消减文库的构建与效价评价  41-44
      2.5.9.1 PCR产物纯化  41-42
      2.5.9.2 PCR产物与T-载体连接(T/A克隆)  42
      2.5.9.3 连接产物转化  42-43
      2.5.9.4 阳性重组菌落的分离培养  43
      2.5.9.5 PCR扩增鉴定克隆插入片段大小  43-44
    2.5.10 消减文库序列分析  44-45
第三章实验结果和讨论  45-64
  3.1 总RNA的提取  45-47
    3.1.1 紫外分光光度计检测结果  45-46
    3.1.2 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果  46-47
  3.2 Rsa Ⅰ酶切效果检测  47-48
  3.3 Tester cDNA接头连接效率检测  48-49
  3.4 PCR扩增结果  49-51
    3.4.1 第一次扩增  49-50
    3.4.2 第二次扩增  50-51
  3.5 消减效率的检测  51-52
  3.6 PCR产物纯化电泳检测结果  52-53
  3.7 消减文库质量的检测  53-55
    3.7.1 蓝白斑筛选阳性克隆  53
    3.7.2 PCR扩增检测消减文库的克隆插入片断大小  53-55
  3.8 消减cDNA序列分析  55-64
结论  64-65
参考文献  65-74
致谢  74

中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达cDNA文库的构建

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