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柿单宁及花青苷跨膜相关基因的克隆与表达分析

作　者: 张凡
导　师: 罗正荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 完全甜柿植物MATE基因单宁细胞单宁跨膜转运花青苷跨膜转运
分类号: S665.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

原花青素(单宁)与花青苷是植物体中重要的黄酮类代谢产物,虽然其前体物质都是在细胞质生成,但二者最终都形成并储存于液泡内。近年来,对于原花青素与花青苷生物合成途径中的大部分结构基因与调控基因都已得到深入研究,目前研究的热点集中在其后期转运机理的探索上。本研究以中国原产完全甜柿‘小果甜柿’(Diospyros kaki Thunb.’Xiaoguo-tianshi’, C-P CNA)为主要试材,以日本原产完全甜柿‘前川次郎’(J-PCNA)和非完全甜柿‘磨盘柿’(non-PCNA)为对照,探讨单宁细胞发育模式以及单宁跨膜关键基因表达及其与果实脱涩的关系,同时克隆了与柿花青苷跨膜相关的关键基因并探讨其与柿果实着色的相关性,以期为完全甜柿自然脱涩机理的研究及其遗传改良提供科学依据。主要研究结果如下：1.中国原产完全甜柿(C-PCNA)单宁积累持续到果实发育晚期(武汉地区9月下旬),并且在果实发育过程中伴有可溶性单宁向不溶性单宁转化的现象。中国原产完全甜柿(C-PCNA)单宁细胞大小与日本原产完全甜柿(J-PCNA)一致,都小于30×103μm2,在形状上为长椭圆形,相比于日本原产完全甜柿(J-PCNA)的细长形更接近非完全甜柿(non-PCNA)的椭圆形。我国原产完全甜柿单宁细胞发育特点介于日本原产完全甜柿(J-PCNA)和非完全甜柿(non-PCNA)之间,且存在可溶性单宁向不溶性单宁转化的现象。2.通过同源克隆从‘小果甜柿’幼果中扩增出长1767bp包含1512bp ORF的MATE基因cDNA全长序列,编码503个氨基酸残基,命名为DkMATEl。该序列有MATE蛋白所特有的两个MatE结构域,并具有12个可能的跨膜区。系统进化分析显示其与原花青素转运MATE蛋白聚为一类,’并发现其表达水平变化与柿单宁积累趋势一致尤其在中国原产完全甜柿中有特异高峰表达,推测DkMATE1转运柿尤其是高效转运中国原产完全甜柿独有的单宁成分。同时DkMATE1与其直接上游基因DkANR具有极为相似的表达模式,DkANR催化花青素生成表儿茶素,而拟南芥AtTT12和蒺藜苜蓿MtMATEl高效转运表儿茶素3,-O-葡萄糖苷,因此推测DkMATE1在柿中转运表儿茶素3’-O-葡萄糖苷。3.从‘小果甜柿’幼果中扩增出另一个MATE基因,命名为DkMATE2,系统进化分析显示其与花青苷转运MATE蛋白聚为一类,并发现随着果实的成熟,该基因表达水平在三种柿果实中都呈逐渐上升的趋势。同时在‘小果甜柿’成熟果实果皮的表达量远高于幼嫩果实的果皮,该表达模式与葡萄中花青苷转运MATE蛋白的表达极为相似。综合分析推测,DkMATE2与柿果实中花青苷的累积相关,推测DkMATE2在柿中负责转运花青苷的前体物质。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
1 前言  11-19
  1.1 课题的提出  11-13
  1.2 前人研究进展  13-18
    1.2.1 单宁研究进展  13-16
      1.2.1.1 植物单宁研究进展概述  13
      1.2.1.2 柿单宁组分与结构  13-14
      1.2.1.3 不同类型柿单宁细胞发育模式研究  14
      1.2.1.4 柿单宁生物合成相关基因研究进展  14-16
    1.2.2 花青苷研究进展概述  16-17
    1.2.3 MATE基因研究进展  17-18
      1.2.3.1 MATE家族基因的基本特征及生理功能  17
      1.2.3.2 原花青素与花青苷跨膜相关MATE基因研究进展  17-18
  1.3 本课题研究内容  18-19
2 材料与方法  19-34
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 主要试剂及仪器  19-20
    2.1.3 菌种和质粒  20
    2.1.4 细菌培养基  20
  2.2 实验方法  20-34
    2.2.1 柿果实单宁含量及单宁细胞大小测定  20-21
      2.2.1.1 相关试剂及其配制方法  20
      2.2.1.2 可溶性单宁及不溶性单宁含量测定  20-21
      2.2.1.3 印迹法测定单宁含量  21
      2.2.1.4 单宁细胞大小测定  21
    2.2.2 基因克隆准备工作  21-24
      2.2.2.1 总RNA提取  21-22
      2.2.2.2 cDNA合成  22
      2.2.2.3 基因组DNA限制性内切酶酶切  22-23
      2.2.2.4 酶切产物的纯化  23-24
      2.2.2.5 酶切产物和接头连接  24
    2.2.3 DkMATE1基因克隆  24-28
      2.2.3.1 DkMATE1基因部分cDNA序列扩增  24-25
      2.2.3.2 DkMATE1基因3’端序列扩增  25-27
      2.2.3.3 DkMATE1基因5’端序列扩增  27
      2.2.3.4 DkMATE1基因DNA及cDNA全长扩增  27-28
    2.2.4 DkMATE2基因克隆  28-31
      2.2.4.1 DkMATE2基因3’端序列扩增  28-29
      2.2.4.2 DkMATE2基因5’端序列扩增  29-31
    2.2.5 目的片段AT克隆测序  31-33
      2.2.5.1 目的片段琼脂糖凝胶电泳检测  31
      2.2.5.2 目的片段回收纯化  31-32
      2.2.5.3 目的片段连接  32
      2.2.5.4 E.coli DH5α感受态细胞的转化  32
      2.2.5.5 阳性克隆的增值及测序片段的选择  32
      2.2.5.6 测序和序列分析  32-33
    2.2.6 实时定量PCR  33-34
      2.2.6.1 RNA提取  33
      2.2.6.2 RNA反转录成cDNA  33-34
3 结果与分析  34-51
  3.1 柿果实发育过程中单宁含量及单宁细胞大小变化  34-39
    3.1.1 果实发育及脱涩情况初探  34-35
    3.1.2 果实发育过程中单宁细胞大小变化  35-36
    3.1.3 果实发育过程中单宁含量变化  36-39
  3.2 总RNA提取和质量检测  39
  3.3 DkMATE1全长克隆及生物信息学分析  39-44
    3.3.1 DkMATE1基因cDNA和DNA全长克隆  39-40
    3.3.2 DkMATE1的基因结构和序列分析  40
    3.3.3 DkMATE1编码蛋白的基本参数  40-43
    3.3.4 DkMATE1编码蛋白的氨基酸序列比较与分子进化分析  43-44
  3.4 DkMATE1的RT-PCR表达情况分析  44-46
    3.4.1 DkMATE1在果实发育过程中的表达模式  44-45
    3.4.2 DkMATE1在不同组织部位中的表达模式  45-46
  3.5 DkMATE2全长克隆及生物信息学分析  46-49
    3.5.1 DkMATE2基因cDNA和DNA全长克隆  46-47
    3.5.2 DkMATE2的序列分析  47-49
  3.6 DkMATE2的RT-PCR表达情况分析  49-51
    3.6.1 DkMATE2在果实发育过程中的表达模式  49-50
    3.6.2 DkMATE2在不同组织部位中的表达模式  50-51
4 讨论  51-54
  4.1 完全甜柿单宁发育模式分析  51
  4.2 DkMATE1基因功能分析  51-54
    4.2.1 DkMATE1蛋白序列及结构特征分析  51-52
    4.2.2 DkMATE1在柿单宁生物合成途径中的功能分析  52-54
      4.2.2.1 该基因为柿单宁生物合成途径中的晚期合成基因  52
      4.2.2.2 推测DkMATEl在柿中转运单宁的前体物质表儿茶素-3’-O-葡萄糖苷  52-53
      4.2.2.3 DkMATE1的表达与完全甜柿单宁积累趋势成正相关,与非完全甜柿不相关  53-54
  4.3 DkMATE2基因功能分析  54
    4.3.1 DkMATE2蛋白序列及结构特征分析  54
    4.3.2 DkMATE2在柿花青苷生物合成途径中的功能分析  54
5 本研究创新之处  54-55
6 进一步工作设想  55-56
参考文献  56-64
附录  64-72
  附表1:引物序列  64-65
  附图1不同发育时期果实图片  65-66
  附图2 DkMATEl DNA全长序列  66-68
  附图3 DkMATEl cDNA全长序列  68-69
  附图4 ZUM47E/编码的氨基酸序列  69-70
  附图5 DkMATE2 cDNA序列  70-71
  附图6 ZUM47E2编码的氨基酸序列  71-72
致谢  72

柿单宁及花青苷跨膜相关基因的克隆与表达分析

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