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河南内乡与四川会理烤烟后期生长发育的分子特征研究

作　者: 贾峰
导　师: 刘卫群
学　校: 河南农业大学
专　业: 烟草学
关键词: 烤烟特色烟叶河南四川代谢 DNA甲基化气象因子
分类号: S572
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本论文大田试验以河南内乡与四川会理大田生产的烤烟(Nicotiana tabacum L.)品种云烟85的上部烟叶为材料,从移栽后60 d开始取样,采集第18片叶同一部位分别:1,检测相关基因的表达量;2,检测化学成分和相关酶活性;3,取烟叶中间部位主脉两侧,用于组织切片的观察。以后每隔10 d取样一次。首先,本文研究了河南内乡与四川会理的烟草在移栽后60-100 d期间烤烟的化学成分及致香成分含量的差异,并分为碳代谢、氮代谢和次生代谢三种代谢相关的物质进行分析,通过分析与三种代谢相关的酶活性及相关基因表达的差异,从分子水平分析这些差异的原因。其次,本文研究了河南内乡与四川会理烟草烟叶中蔗糖和类胡萝卜素合成相关的关键基因(蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合酶和番茄红素β-环化酶)的变化,以及这些基因与温度、光照和温度与光照交互作用之间的关系,为调控这些基因的表达奠定理论和技术基础。再者,本文建立了烤烟DNA甲基化水平的HPLC检测方法,并以确山烟叶生长期间主要的四个气象因子温度、日照、降水、湿度和烟叶DNA甲基化水平之间建立了Logistic方程的数学模型,研究烟草生长过程中气象因子与DNA甲基化之间的交互作用,从分子水平上探讨气象因子对烟叶生理生化的影响,为深入研究特色烟叶的形成与气象因子的关系提供依据。本论文通过相关的试验,得出的主要结论如下:1,河南内乡与四川会理烤烟的生长期不太一致,河南内乡的烟叶前期生长快,后期生长慢;会理的烟叶表现前期慢,后期生长较快。河南内乡与四川会理烟叶可溶性总糖、类胡萝卜素及其降解产物含量的差异较大。河南内乡与四川会理烟叶在移栽后60-100 d期间,烟叶的可溶性总糖的含量变化均为单峰曲线,在移栽后70 d达到高点,随后可溶性总糖的含量逐渐下降,到移栽后100 d时,烟叶中可溶性总糖的含量达到最低。烤后会理烟叶中可溶性总糖比内乡烟叶的要高1.5倍。2,在烟草移栽后60-80 d烟叶中蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性会理高于内乡烟叶,而到移栽90 d后,会理烟叶中SPS酶活性迅速降低,并且SPS酶活性低于内乡的。在烟草移栽后60-90 d烟叶中蔗糖合酶(SS)的活性会理低于内乡烟叶,而到移栽90 d后,内乡烟叶中SS酶活性降低的较快,并且会理SS酶活性高于内乡的。3,对烤烟叶圆片进行的温度和光照正交试验的结果表明,温度和光照处理能够下调或上调SPS和SS基因的表达,只有在适当的温度和光照条件下,才有利于SPS基因的表达。在较高温度和光照强度条件下,有利于SS基因的表达。极差的结果表明,三个因子对SPS和SS基因表达的影响作用的大小顺序一样,即(温度×光照强度)>光照强度=温度。Duncan’s测验比较结果表明:温度×光照强度分别对SPS和SS基因的表达影响较大,且达到差异显著水平(P<0.05)。4,SPS和SS基因的表达量和Northern杂交的结果表明,四川会理烟叶中SPS基因表达水平明显高于河南内乡烟叶。四川会理烟叶中SS基因的杂交带亮度稍高于河南内乡烟叶的条带亮度,表明四川会理烟叶中SS基因表达水平稍高于河南内乡烟叶。现蕾期四川会理烟叶SPS酶活性比河南内乡烟叶提高有利,而两地区烟叶SS酶活性的差异不大。四川会理烟叶的可溶性总糖的含量高于河南内乡的原因是:四川会理烟叶中SPS酶活性和SPSA基因的表达高于内乡烟叶,而四川会理烟叶中SS酶活性和SS基因的表达与河南内乡烟叶的差异不大,使得糖分在烟叶中积累。5,两地区烟叶中烟碱含量随着烟叶的成熟有逐渐增加的趋势,而烟叶中总氮和蛋白质的含量却随着烟叶的成熟逐渐下降。游离氨基酸的变化为,内乡烟叶在移栽后70 d达到高峰,随后逐渐下降。在移栽后60-100 d期间,NR酶活性和基因表现为逐渐下降,且会理烟叶中NR酶活性一直高于内乡烟叶;河南内乡与四川会理烟叶中GS基因的表达在此期间均表现逐渐下降,GS酶活性也表现为会理烟叶大于内乡;而河南内乡与四川会理烟叶中GDH基因的表达表现为逐渐升高的趋势,且四川会理烟叶中GDH基因的表达比河南内乡烟叶中该基因表达要高。6,在现蕾期四川会理烤烟上部叶中类胡萝卜素的含量显著高于河南内乡的,基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern杂交的结果表明,四川会理烟叶中Lyc-β基因表达水平明显高于河南内乡烟叶。Lyc-β基因的表达受到温度和光照的调节,对Lyc-β基因的表达影响的顺序是,光照强度>温度>温度×光照强度,且三因素的三个水平之间没有显著差异(P<0.05)。较高光照的条件下,Lyc-β基因的表达是较低光照的1.60倍;温度为30℃时,Lyc-β基因的表达最高,温度在25℃时次之;温度在35℃时最小。在光照时间为2-6 h期间,Lyc-β基因随着光照时间的延长表达量增加,但光照处理超过8 h之后,Lyc-β基因随着光照时间的延长表达量下调。总之,光照和温度可能是通过调节lyc-β基因的表达造成不同生态区烟叶中类胡萝卜素差异的原因。7,气象因子与DNA甲基化之间Logistic模型的单因子效应分析表明,平均最高温度的升高对DNA甲基化水平的升高影响最大;总日照长度的延长也会提高烟叶DNA甲基化水平;平均相对湿度对DNA甲基化的影响不大;总降雨量的增加能够降低总DNA甲基化水平,虽然其系数绝对值较小,但总降雨量的数值较大,同样对DNA去甲基化水平的影响幅度也大。总之,平均最高温度、总日照时数、平均相对湿度与DNA甲基化水平正相关;总降雨量与DNA甲基化水平负相关。两因素交互效应分析表明,平均最高温度和平均相对湿度、平均最高温度和总日照时数之间对烟叶的DNA甲基化具有协同效应;总降雨量和平均最高温度、总降雨量和总日照时数、总降雨量和平均相对湿度之间对烟叶的DNA甲基化有拮抗作用;而平均相对湿度与总日照时数之间对烟叶的DNA甲基化水平没有明显的协同效应或拮抗作用。

全文目录

致谢  5-11
摘要  11-13
1 文献综述  13-26
  1.1 特色烟叶的概念  13-14
  1.2 特色烟叶的分类  14
  1.3 特色烟叶形成的内因  14-19
    1.3.1 碳代谢相关成分对特色烟叶形成的影响  14-16
      1.3.1.1 糖对特色烟叶形成的影响  15
      1.3.1.2 淀粉对特色烟叶形成的影响  15-16
      1.3.1.3 纤维素对特色烟叶形成的影响  16
    1.3.2 氮代谢相关成分对特色烟叶形成的影响  16-18
      1.3.2.1 游离氨基酸对特色烟叶形成的影响  17
      1.3.2.2 烟碱对特色烟叶形成的影响  17-18
    1.3.3 次生代谢及相关成分对特色烟叶形成的影响  18-19
      1.3.3.1 有机酸对特色烟叶形成的影响  18
      1.3.3.2 质体色素对特色烟叶形成的影响  18
      1.3.3.3 中性致香成分对特色烟叶形成的影响  18-19
  1.4 特色烟叶形成的外因  19-24
    1.4.1 气象条件对特色烟叶形成的影响  19-21
      1.4.1.1 光照对特色烟叶形成的影响  19-20
      1.4.1.2 温度对特色烟叶形成的影响  20-21
      1.4.1.3 降雨/湿度对特色烟叶形成的影响  21
    1.4.2 环境因素条件对特色烟叶形成的影响  21-22
      1.4.2.1 土壤条件对特色烟叶形成的影响  21-22
      1.4.2.2 海拔对特色烟叶形成的影响  22
    1.4.3 栽培措施对特色烟叶形成的影响  22-24
      1.4.3.1 肥料对特色烟叶形成的影响  22-23
      1.4.3.2 农艺措施对特色烟叶形成的影响  23-24
    1.4.4 不同烟草基因型对特色烟叶形成的影响  24
  1.5 本研究目的与意义  24-25
  1.6 本研的创新点  25-26
第一章河南内乡与四川会理烤烟理化和致香成分的差异研究  26-36
  1 材料与方法  26-27
    1.1 实验设计  26
    1.2 测定方法  26-27
    1.3 统计分析  27
  2 结果与分析  27-35
    2.1 河南内乡与四川会理烤烟农艺性状和烟叶组织结构的差异  27-30
    2.2 河南内乡与四川会理烤烟常规化学成分和质体色素含量的差异  30-31
    2.3 河南内乡与四川会理烤烟有机酸和多酚类物质含量的差异  31-33
    2.4 河南内乡与四川会理烤烟中性致香成分含量的差异  33-35
  3 结论  35-36
第二章河南内乡与四川会理烤烟碳代谢差异的研究  36-43
  1 材料与方法  36-38
    1.1 实验设计  36
    1.2 测定方法  36-38
  2 结果与分析  38-42
    2.1 河南内乡与四川会理烤烟糖含量和碳代谢关键酶活性的差异  38-39
    2.2 河南内乡与四川会理烤烟碳代谢关键酶活性的差异  39-40
    2.3 河南内乡与四川会理烤烟碳代谢相关基因表达的差异  40-42
  3 结论  42
  4 讨论  42-43
第三章河南内乡与四川会理烤烟氮代谢差异的研究  43-47
  1 材料与方法  43-44
    1.1 实验设计  43
    1.2 测定方法  43-44
  2 结果与分析  44-46
    2.1 河南内乡与四川会理烤烟含氮化合物的差异  44
    2.2 河南内乡与四川会理烤烟氮代谢关键酶活性的差异  44-45
    2.3 河南内乡与四川会理烤烟氮代谢关键基因的表达差异  45-46
  3 结论  46-47
第四章河南内乡与四川会理烤烟次生代谢差异的研究  47-52
  1 材料与方法  47
    1.1 实验设计  47
    1.2 测定方法  47
  2 结果与分析  47-50
    2.1 河南内乡与四川会理烤烟次生代谢化合物的差异  47-48
    2.2 河南内乡与四川会理烤烟次生代谢关键酶活性的差异  48-49
    2.3 河南内乡与四川会理烤烟次生代谢相关基因表达差异比较  49-50
  3 结论  50-52
第五章河南内乡与四川会理烤烟类胡萝卜素含量差异的研究  52-56
  1 材料与方法  52-53
    1.1 实验材料  52
    1.2 烤烟RNA 提取、RT-PCR 扩增和Northern 杂交方法  52-53
    1.3 类胡萝卜素检测及数据处理方法  53
  2 结果分析  53-54
    2.1 烤烟RNA 电泳检测结果  53
    2.2 烤烟Lyc-β引物和内参Actin 引物RT-PCR 结果分析  53
    2.3 烤烟Lyc-β基因表达的Northern 杂交结果分析  53-54
    2.4 烤烟上部烟叶类胡萝卜素含量变化  54
  3 结论  54-55
  4 讨论  55-56
第六章河南内乡与四川会理烤烟现蕾期蔗糖含量差异的研究  56-62
  1 材料与方法  56-57
    1.1 试验材料  56-57
    1.2 试验设计  57
    1.3 试验方法  57
  2 结果分析  57-60
    2.1 河南内乡与四川会理烤烟现蕾期SPS 和SS 基因表达的差异  57-59
    2.2 河南内乡与四川会理烤烟现蕾期SPS 和SS 酶活性表达的差异  59
    2.3 河南内乡与四川会理烤烟现蕾期可溶性总糖和蔗糖含量的变化  59
    2.4 温度和光照强度对SPS 和SS 基因表达的影响  59-60
  3 结论  60-61
  4 讨论  61-62
第七章内乡与会理烤烟番茄红素β-环化酶基因表达差异的分析  62-68
  1 材料与方法  62-64
    1.1 试验设计  62-63
    1.2 试验方法  63-64
    1.3 类胡萝卜素检测  64
    1.4 统计方法  64
  2 结果与分析  64-66
    2.1 不同生态条件对烤烟lyc-β基因表达及类胡萝卜素含量的影响  64-65
    2.2 温度与光照对烤烟lyc-β基因的影响  65-66
    2.3 光照时间对烤烟lyc-β基因表达的影响  66
  3 结论  66-67
  4 讨论  67-68
第八章烤烟DNA 甲基化与气象因子的关系分析  68-77
  1 材料与方法  69-71
    1.1 试验地概况  69
    1.2 试验设计  69
    1.3 测定方法  69-70
    1.4 气象数据的获取与统计分析处理  70
    1.5 气象因子与烤烟DNA 甲基化的灰色关联分析  70
    1.6 修正的Logistic 方程构建  70
    1.7 计算及统计分析方法  70-71
  2 结果与分析  71-74
    2.1 大田期气象因子与烤烟DNA 甲基化的测定结果  71
    2.2 烤烟DNA 甲基化与气象因子之间的灰色关联分析  71-72
    2.3 四个气象因子与烤烟DNA 甲基化的Logistic 模型构建及分析  72-74
  3 结论  74-75
  4 讨论  75-77
    4.1 气象因子对烤烟DNA 甲基化的调节途径  75
    4.2 烤烟DNA 甲基化对基因表达的调节  75-77
参考文献  77-87
Abstract  87-90
缩写符号及中英文对照表  90-91
攻读博士学位期间发表的相关文章  91

河南内乡与四川会理烤烟后期生长发育的分子特征研究

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