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一株产功能成分DMC的水翁内生真菌的分离鉴定及其发酵的研究

作　者: 汪杰
导　师: 卢艳花
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: Ceriporia lacerata DMC1106 2’,4’-二羟基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮水翁内生真菌发酵
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水翁[Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry]是一种分布于(亚)热带多年生的大型药用常绿乔木被子植物,属于桃金娘科水榕属,其花蕾称水翁花,呈卵圆形或球形,干燥粉末为棕褐色,味苦、性寒,具有清热解毒、消食化滞的功效,在民间常做凉茶应用。2’,4’-二羟基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮(DMC)是从水翁花中分离出来的具有广泛药理活性的化合物,文献报道其具有抗肿瘤、抗菌消炎、保肝护肝、降血糖、保护神经细胞、解痉挛、增强免疫力等生物活性。目前,DMC主要从药用植物水翁花中分离提取获得,但水翁生长缓慢、野生资源稀少,且花蕾中DMC含量低。因此,寻找新的生产方法,解决DMC资源问题,对于促进水翁花的开发利用非常重要。植物内生真菌是广泛存在于健康植物组织内部而不引起植物明显症状改变的菌,能够产生结构新颖、功能特殊的次生代谢产物,有些内生真菌还可以产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物,它已经成为解决植物来源的天然产物生产的重要途径。本论文从水翁根、茎、叶、花蕾中共分离出69株内生真菌,其中产DMC的菌株有10株,菌株DMC1106产DMC的能力最强,进一步对菌株DMC1106菌种和产物鉴定及发酵条件进行了研究。通过微生物菌落形态学、内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)保守序列及系统进化树分析,菌株DMC1106被归属为担子菌门(Basidiomycota)担子菌纲(Basidiomycetes)(?)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyoraceae)蜡质菌属(Ceriporia Donk)撕裂蜡孔菌种(Ceriporia lacerata),命名为Ceriporia lacerata DMC1106。高效液相色谱(HPLC)、紫外扫描及液相-质谱联用(LC-MS)实验证明菌株DMC1106可合成DMC。单因素实验、Placket-Burman设计实验、最陡爬坡实验及Box-Behnken响应面设计实验表明,菌株DMC1106的最佳发酵培养基成分：蔗糖20g/L,蛋白胨10g/L, MgSO4·7H2O0.72g/L, KH2PO44g/L, oxalic acid0.34g/L, L-phenylalanine0.78g/L, pH为4.8-5.0;最佳发酵参数为：500mL三角瓶中装液200mL,接种量20%,转速150rpm,28±2℃培养6天。在最佳发酵工艺下,DMC产量从最初的14.60±0.50μg/L提高到100.24±1.60μg/L,产量提高了将近6倍。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章前言  10-23
  1.1 植物内生菌研究现状  10-15
    1.1.1 植物内生菌的发现  10-11
    1.1.2 植物内生菌的生物多样性  11
    1.1.3 植物内生菌的生物学作用  11-13
      1.1.3.1 植物内生菌促进植物生长  11-12
      1.1.3.2 植物内生菌增强宿主植物抗性  12
      1.1.3.3 植物内生菌促进宿主植物活性成分的产生与积累  12-13
    1.1.4 植物内生菌次生代谢产物的多样性  13-14
    1.1.5 植物内生菌的潜在应用价值  14-15
    1.1.6 植物内生菌研究过程中存在的问题  15
  1.2 微生物发酵生产次级代谢产物的研究  15-19
    1.2.1 次级代谢产物与初级代谢产物关系  15-16
    1.2.2 次级代谢产物的调节  16-19
      1.2.2.1 碳、氮源对次级代谢产物合成的影响  16-17
      1.2.2.2 磷酸盐、金属离子对次级代谢产物合成的影响  17-18
      1.2.2.3 生物合成前体供应对次级代谢产物合成的影响  18-19
      1.2.2.4 外界条件对次级代谢产物合成的影响  19
  1.3 水翁及其活性成分DMC的研究进展  19-21
    1.3.1 水翁概述  19-20
    1.3.2 DMC的化学结构及生物活性  20
    1.3.3 DMC的来源  20-21
  1.4 立题依据及主要研究内容  21-23
    1.4.1 立题依据  21
    1.4.2 主要研究内容  21-23
第二章一般实验材料与方法  23-26
  2.1 常用的实验材料  23-24
    2.1.1 培养基  23
    2.1.2 常用试剂  23-24
    2.1.3 一般化学试剂  24
  2.2 仪器与设备  24
  2.3 常用实验方法  24-26
    2.3.1 菌株发酵产物处理方法  24-25
    2.3.2 DMC的HPLC检测条件  25-26
第三章水翁内生真菌的分离与保藏  26-31
  3.1 实验材料  26-27
    3.1.1 供试植物材料  26
    3.1.2 主要试剂与仪器  26-27
    3.1.3 培养基配制  27
  3.2 实验方法  27-28
    3.2.1 水翁外植体的预处理  27
    3.2.2 水翁外植体消毒及内生真菌的分离  27
    3.2.3 新鲜水翁组织内部菌丝观察  27
    3.2.4 水翁内生真菌的纯化  27-28
    3.2.5 水翁内生真菌保藏  28
  3.3 结果分析与讨论  28-30
    3.3.1 水翁外植体消毒时间确定  28
    3.3.2 新鲜水翁组织内部菌丝观察  28-29
    3.3.4 水翁内生真菌的分离纯化  29-30
    3.3.5 水翁内生真菌在不同组织部位中的分布  30
  3.4 小结  30-31
第四章产功能成分DMC的菌株筛选  31-35
  4.1 实验材料  31-32
    4.1.1 实验菌株  31
    4.1.2 主要试剂与仪器  31-32
    4.1.3 培养基配制  32
  4.2 实验方法  32
    4.2.1 水翁内生真菌的摇瓶培养  32
    4.2.2 水翁内生真菌发酵产物处理及DMC的HPLC检测条件  32
    4.2.3 产DMC菌株筛选方法  32
  4.3 结果与分析  32-34
  4.4 讨论  34
  4.5 小结  34-35
第五章水翁内生真菌DMC1106代谢产物DMC及其菌种鉴定  35-47
  5.1 实验材料  35-36
    5.1.1 菌株与引物  35
    5.1.2 主要试剂与仪器  35-36
    5.1.3 培养基配制  36
  5.2 实验方法  36-38
    5.2.1 种子液制备和液体摇瓶培养  36
    5.2.2 菌株DMC1106发酵代谢产物DMC的鉴定  36-37
      5.2.2.1 DMC的提取及HPLC检测  36
      5.2.2.2 LC-HR-MS/MS分析  36-37
    5.2.3 菌株DMC1106菌落形态观察  37
    5.2.4 菌株DMC1106显微形态观察  37
    5.2.5 菌株DMC1106ITS序列测定及分析  37-38
  5.3 结果与分析  38-46
    5.3.1 菌株DMC1106发酵产物的高效液相色谱分析  38-39
    5.3.2 菌株DMC1106发酵产物的高分辨率质谱分析  39-41
    5.3.3 菌株DMC1106菌落形态观察结果  41
    5.3.4 菌株DMC1106显微形态观察结果  41-42
    5.3.5 菌株DMC1106摇瓶培养形态观察结果  42-44
    5.3.6 菌株DMC1106ITS序列测定及系统进化树分析  44-46
  5.4 讨论  46
  5.5 小结  46-47
第六章 Ceriporia lacerata DMC1106发酵生产DMC初步研究  47-69
  6.1 实验材料  47
    6.1.1 培养基  47
    6.1.2 试剂与器材  47
  6.2 实验方法  47-49
    6.2.1 种子液制备及液体发酵培养基础条件  47-48
    6.2.2 液体发酵产物DMC的提取及菌株生物量的测定  48
    6.2.3 DMC含量测定  48-49
      6.2.3.1 DMC标准品溶液的配置  48
      6.2.3.2 DMC的高效液相分析  48-49
  6.3 实验内容  49-51
    6.3.1 Ceriporia lacerata DMC1106发酵生长周期  49
    6.3.2 Ceriporia lacerata DMC1106发酵的单因素优化实验  49-50
    6.3.3 统计学方法优化Ceriporia lacerata DMC1106发酵培养基  50
    6.3.4 验证实验  50
    6.3.5 数据统计与分析  50-51
  6.4 结果与分析  51-68
    6.4.1 标准曲线的制备  51
    6.4.2 精密度实验  51
    6.4.3 稳定性实验  51-52
    6.4.4 重现性实验  52
    6.4.5 Ceriporia lacerata DMCl 106 发酵样品测定结果  52-53
    6.4.6 Ceriporia lacerata DMC1106发酵生长周期特性  53
    6.4.7 Cerporia lacerata DMC1106发酵的单因素优化  53-61
    6.4.8 Placket-Burman设计实验筛选发酵培养基中的关键因素  61-63
    6.4.9 最陡爬坡设计实验筛选培养基组分中关键因素的最佳区域  63
    6.4.10 Box-Behnken响应面设计实验筛选关键因素的最优水平  63-67
    6.4.11 验证实验分析  67-68
  6.5 讨论  68
  6.6 小结  68-69
第七章结论  69-70
  7.1 主要结论  69
  7.2 主要创新点  69-70
参考文献  70-76
致谢  76-77
硕士期间研究成果  77

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