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鹰嘴豆肽生物活性及构效关系解析

作　者: 高捷
导　师: 寇晓虹; 薛照辉
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 分离纯化生物活性抗肿瘤构象
分类号: S529
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人类摄食的蛋白质经过消化道消化后，主要以低聚肽的形式被吸收，某些具有生物活性的低聚肽以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，其活性被释放出来，不仅易于消化吸收，而且还具有多种调节人体代谢及生理功能的作用，是开发功能性食品和筛选药物的天然资源宝库。在我国，鹰嘴豆是一种天然植物蛋白资源，所含营养丰富，并具有多种生理功能，还是一味维族民间药和传统中药，且鹰嘴豆肽也已经成为了植物源活性肽的研究热点之一。本文选择碱性蛋白酶(Alcalase)和复合风味酶(Flavourzyme)分步水解来制备鹰嘴豆肽(CPe)。通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析进行分离纯化，得到Fra-I、II、III共三个级分。在鹰嘴豆肽体内抑瘤实验中通过CPe灌胃，以环磷酰胺为对照，观察CPe对小鼠状态的影响，测定体重、肿瘤大小、抑瘤率、胸腺指数、脾指数、巨噬细胞吞噬能力、脾细胞吞噬能力等免疫指标，以及MDA、SOD和NO等抗氧化指标。表明不同浓度的鹰嘴豆肽对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长都有一定的抑制作用，可以提高荷瘤小鼠免疫器官的重量，增强荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞转化能力、DNFB诱导的迟发型超敏反应，提示CPe对荷瘤小鼠的特异性和非特异性免疫功能具有明显增强作用，而且CPe能显著提高荷瘤小鼠体内抗氧化酶SOD的活性，减少脂质过氧化产物MDA的含量，揭示CPe可提高机体抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用。采用液质联用、傅里叶-拉曼光谱、傅里叶-红外光谱、分子模拟等技术对CPe-III构象进行了深入研究与分析。通过液质联用一级质谱得到CPe-III的相对分子质量为1155Da，利用BioWorks3.3并结合二级质谱结果分析推测出其氨基酸序列为RQSHFANAQP。傅里叶-拉曼光谱和红外光谱所得结果对质谱结果进行验证，并进一步得出CPe-III的二级结构可能含有α-螺旋(66%)和卷曲结构(21%)。通过分子动力学模拟技术对CPe-III的空间结构进行预测和模拟，并对CPe-III的构效关系进行了解析与探讨。本研究对鹰嘴豆肽的生物活性和构象进行了系统深入的研究，为天然活性肽在功能食品开发及生物医药中的应用提供了科学依据和理论基础，同时为植物源活性肽的开发与应用提供了新的思路。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-10
第一章文献综述  10-16
  1.1 生物活性肽  10-11
    1.1.1 生物活性肽的研究进展  10-11
    1.1.2 生物活性肽的分类与功能  11
  1.2 鹰嘴豆简介  11-13
    1.2.1 鹰嘴豆黄酮类生物活性物质  12
    1.2.2 鹰嘴豆蛋白  12
    1.2.3 鹰嘴豆活性肽  12-13
  1.3 蛋白质结构的鉴定  13-14
  1.4 本研究的背景、目的和意义  14-15
  1.5 研究内容  15-16
第二章鹰嘴豆肽的制备及抗氧化活性测定  16-22
  2.1 实验材料  16
    2.1.1 实验仪器  16
    2.1.2 主要试剂  16
  2.2 实验方法  16-18
    2.2.1 鹰嘴豆肽的制备  16-17
    2.2.2 鹰嘴豆肽抗氧化活性测定  17-18
  2.3 结果与分析  18-21
    2.3.1 鹰嘴豆肽还原能力  18-19
    2.3.2 鹰嘴豆肽清除 OH 自由基的能力  19-20
    2.3.3 鹰嘴豆肽清除 ABTS 自由基的作用  20-21
    2.3.4 鹰嘴豆肽清除 DPPH 自由基的能力  21
  2.4 小结  21-22
第三章鹰嘴豆肽的抗肿瘤活性  22-37
  3.1 实验材料  22-23
    3.1.1 药物和试剂  22
    3.1.2 仪器  22-23
    3.1.3 实验动物及细胞  23
    3.1.4 主要溶液配制  23
  3.2 实验方法  23-26
    3.2.1 动物分组  23
    3.2.2 接种方法  23-24
    3.2.3 肿瘤抑制实验  24
    3.2.4 迟发型超敏反应  24
    3.2.5 巨噬细胞吞噬实验  24-25
    3.2.6 MTT 法淋巴细胞转化实验  25-26
    3.2.7 组织形态观察  26
    3.2.8 肝脏组织中 SOD、MDA 含量的测定  26
    3.2.9 血清中 NO 含量的测定  26
  3.3 结果与讨论  26-35
    3.3.1 小鼠状态的观察  26-27
    3.3.2 接种后肿瘤体积变化曲线  27-28
    3.3.3 鹰嘴豆肽对 H22 肝癌小鼠的抑瘤作用和对小鼠免疫器官的影响  28-29
    3.3.4 鹰嘴豆肽对 H22 肝癌小鼠迟发型超敏反应的影响  29
    3.3.5 脾淋巴细胞转化能力  29-30
    3.3.6 巨噬细胞吞噬能力  30-31
    3.3.7 肿瘤形态及肝组织 HE 染色  31-32
    3.3.8 肝组织中 SOD、MDA 含量的测定  32-33
    3.3.9 血清中 NO 含量的测定  33-35
  3.4 小结  35-37
第四章鹰嘴豆肽的分离纯化及构效解析  37-64
  4.1 实验仪器  37-38
  4.2 实验方法  38-39
    4.2.1 凝胶色谱分离纯化鹰嘴豆肽  38
    4.2.2 鹰嘴豆肽各组分的活性鉴定  38
    4.2.3 鹰嘴豆肽组分 Fra-III 的氨基酸含量测定  38
    4.2.4 液质联用（LC-ESI-MS/MS）  38-39
    4.2.5 傅里叶-拉曼光谱  39
    4.2.6 傅里叶变换红外光谱  39
    4.2.7 CPe-III 的二级结构及理化预测  39
    4.2.8 分子动力学模拟  39
  4.3 结果与分析  39-64
    4.3.1 凝胶过滤色谱结果  39-40
    4.3.2 鹰嘴豆肽各组分活性鉴定  40-42
    4.3.3 鹰嘴豆肽 Fra-III 的氨基酸种类与含量  42-44
    4.3.4 鹰嘴豆肽 Fra-III 的质谱分析  44-48
    4.3.5 鹰嘴豆肽 CPe-III 的傅里叶-拉曼光谱分析  48-53
    4.3.6 CPe-III 的红外光谱分析  53-58
    4.3.7 CPe-III 的结构及理化性质预测  58-60
    4.3.8 CPe-III 的分子动力学模拟  60-62
    4.3.9 CPe-III 的构效关系  62-64
第五章全文结论  64-65
参考文献  65-75
发表论文和参加科研情况说明  75-76
致谢  76

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