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磷脂酶C和磷脂酶D在核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫反应中的作用

作　者: 王莲莲
导　师: 梁元存
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 烟草核黄素 PLC PLD 防卫反应
分类号: S432.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

核黄素作为植物防卫反应的激发子,可增强植物对由真菌、卵菌、细菌、病毒等病害的抗性。但是,其防卫机制并不清楚。磷脂酶C (phospholipase C, PLC)信号和磷脂酶D (phospholipase D, PLD)信号途径在动植物防卫反应中起着重要作用。PLC的水解产物二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol1,4,5-trisphosphate,以及PLC和PLD的共同产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA).目前对于PLC信号途径和PLD信号途径是否参与了烟草悬浮细胞中核黄素诱导的防卫反应还缺乏系统研究。本文运用药理学方法研究烟草悬浮细胞,为了确定核黄素激发的防卫反应是否依赖于PLC和PLD途径。通过采用生物化学、细胞化学、半定量RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)、荧光定量PCR (Real-time, PCR)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)等技术测定了一系列防卫反应。所得结果如下：1、烟草悬浮细胞受核黄素诱导后NtPLC1表达量没有明显变化,但其它PLC和PLD基因的表达量均明显增加。NtPLD (NtPLDa2, NtPLDa3, NtPLDβ1和NtPLDδ)基因的表达水平也表现出差异。2、为了阐明PLC和PLD是否参与了核黄素诱导的烟草悬浮细胞的过氧化氢(H2O2)的产生,用PLC的特异性抑制剂U73122和PLD的抑制剂1-butanol提前处理核黄素诱导的细胞,测定细胞过氧化氢被抑制情况。结果表明U73122(10μmol/L)和1-butanol (0.1%, v/v)对核黄素诱导的过氧化氢产生的抑制率分别为79.5%和62.9%。但是U73343(U73122的类似物)和tert-butanol (1-butanol的类似物)没有作用。这些结果表明PLC和PLD途径都参与了核黄素诱导的烟草悬浮细胞的过氧化氢的产生。另外,核黄素还能诱导一氧化氮(nitric oxide, NO)的生成。3、提前加入PLC抑制剂(U73122)和PLD的抑制剂(1-butanol)处理核黄素诱导的烟草悬浮细胞后,3种防卫基因PR (pathogenesis-related)-1a、PR-1b及PAL等的表达受到不同程度的抑制。4、PLC和PLD抑制对核黄素诱导的scopoletin积累有显著地抑制作用。而U73343和tert-butanol对核黄素诱导的防卫反应没有任何作用。外源施用磷脂酸能诱导烟草悬浮细胞中scopoletin积累,磷脂酸能部分地恢复细胞外抑制剂导致的scopletin累积量减少。

全文目录

中文摘要  7-8
Abstract  8-10
1 引言  10-31
  1.1 激发子启动的细胞信号传导  10-17
    1.1.1 激发子  10-11
    1.1.2 植物激发子的种类  11-12
      1.1.2.1 寡糖  11-12
      1.1.2.2 肽和蛋白  12
      1.1.2.3 糖蛋白  12
    1.1.3 核黄素  12-14
      1.1.3.1 核黄素在植物抗病防卫和生长信号传导中的作用  13
      1.1.3.2 核黄素介入植物抗病信号传导的可能过程  13-14
    1.1.4 激发子诱导细胞信号传导组成部分  14-15
    1.1.5 细胞信号的分类  15-16
    1.1.6 细胞化学信号分子与信号传递途径的特征  16-17
  1.2 植物细胞磷脂信号系统研究进展  17-26
    1.2.1 植物细胞磷脂酶的类别及结构特点  17-19
    1.2.2 植物磷脂酶生化分析  19-20
    1.2.3 磷脂酶基因及表达模式  20-21
    1.2.4 植物磷脂酶的主要生理作用  21-26
      1.2.4.1 种子萌发  21-22
      1.2.4.2 细胞分化和生长  22
      1.2.4.3 光信号  22
      1.2.4.4 衰老  22-23
      1.2.4.5 气孔开口的控制  23
      1.2.4.6 高尔基体新生小泡释放  23-24
      1.2.4.7 协助mRNA的核外运  24
      1.2.4.8 抗逆境  24
      1.2.4.9 渗透压调节  24-25
      1.2.4.10 PLC和PLD在植物防卫反应中的作用  25-26
  1.3 激发子诱导的防卫反应  26-30
    1.3.1 蛋白质可逆磷酸化作用  26
    1.3.2 G-蛋白  26
    1.3.3 活性氧的产生  26-27
    1.3.4 离子流动和膜去极化  27-28
    1.3.5 一氧化氮的产生  28
    1.3.6 防卫基因的表达  28-29
    1.3.7 植保素的积累  29-30
  1.4 研究的目的意义  30-31
2 材料与方法  31-39
  2.1 试验材料  31-34
    2.1.1 生化和分子试剂  31
    2.1.2 培养基的配制  31-32
    2.1.3 PCR引物  32-33
    2.1.4 烟草悬浮细胞培养和诱导处理  33-34
  2.2 烟草悬浮细胞总RNA的提取和纯度测定  34
  2.3 荧光实时定量PCR(Real-time PCR)  34-36
    2.3.1 cDNA第一链的合成  34-35
    2.3.2 PCR反应体系及程序  35
    2.3.3 Real Time-PCR结果分析  35-36
  2.4 烟草悬浮细胞胞外H_2O_2含量测定  36-37
  2.5 NO的定量测定和定性测定  37-38
    2.5.1 NO的定量测定  37
    2.5.2 NO的定性测定  37-38
  2.6 RT-PCR分析烟草防卫基因表达  38
  2.7 Scopoletin含量测定  38-39
3 结果与分析  39-49
  3.1 核黄素诱导后PLC和PLD基因的表达模式  39-40
  3.2 PLC和PLD抑制剂对H_2O_2产量的影响  40-42
  3.3 NO胞外的定性测定和胞内定量的测定  42-44
  3.4 PLC和PLD抑制剂在防卫基因表达方面的作用  44-45
  3.5 PLC和PLD抑制剂和PA在胞内植保素积累的作用  45-47
  3.6 PA对植保素积累的影响  47-49
4 讨论  49-54
  4.1 NtPLCs和NtPLDs经处理后具有不同的表达特征  49-50
  4.2 PLC和PLD途径对烟草悬浮细胞胞外H202产量的影响  50-51
  4.3 NO胞外的定性测定和胞内定量的测定  51-52
  4.4 PLC和PLD在防卫基因表达方面的作用  52
  4.5 抑制剂和PA在胞内植保素积累的作用  52-54
总结与展望  54-56
  1 全文总结  54-55
  2 研究展望  55-56
参考文献  56-70
致谢  70-71
攻读学位期间发表论文情况  71

磷脂酶C和磷脂酶D在核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫反应中的作用

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