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复合诱变和原生质体融合选育S—腺苷甲硫氨酸酿酒酵母高产菌株

作　者: 封晓霞
导　师: 王雅琴
学　校: 北京化工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: S-腺苷甲硫氨酸 酿酒酵母 复合诱变 原生质体融合
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


S-腺苷蛋氨酸(SAM)是细胞内重要的生理活性物质,具有转甲基、转氨丙基、转硫基等生理功能,能够预防和治疗关节炎、抑郁症、肝病等疾病,在国内外都有很大的市场需求。但是由于菌种问题及技术不成熟,在我国还没有实现工业化生产。本文利用复合诱变和原生质体融合技术选育SAM的酿酒酵母菌株。主要工作如下：1.比较了冻融法、乙醇提取法和高氯酸法对酿酒酵母细胞破碎提取SAM的不同效果,发现东融法和乙醇法对SAM的稳定性有很大影响,容易造成SAM的损失,不利于SAM的提取。高氯酸法细胞破碎效果最好,释放的SAM量最多,选为SAM的提取方法。研究并建立了SAM的分析测定方法,选择精确而高效的HPLC法进行测定,SAM的保留时间在7min左右,每个样品药10min就可测定完毕。2.对13个出发菌株进行了生孢鉴定并测定了它们的生物量和SAM产量,从中选择出SAM产量高的出发菌株R1进行单倍体分离,得到60株单倍体。对其中SAM产量较高的单倍体hR10进行UV和DES复合诱变,在含有10μg/mL制霉菌素的平板上进行筛选,最后获得4株SAM产量有明显改善的菌株DR1-3、NM14、NM39、NM45,与各自的出发菌株相比SAM产量分别提高了34.3%、10.9%、14.1%、18.7%。3.以DR1-3、NM14、NM39、NM45为亲本,通过双亲灭活法进行标记,运用PEG诱导亲本的融合,在含有20μg/mL制霉菌素的双层平板上进行筛选,共得到90个融合子,对它们的生物量及SAM产量进行测定,最后筛选到一株SAM产量有明显提高的融合子F35,其SAM产量为22.5mg/L,与出发菌株R1相比提高了103%；SAM含量为1.97mg/gDCW,是出发菌株R1的近2倍,并且遗传稳定性实验表明其F35的SAM高产性状稳定。4.优化了融合子F35发酵生产SAM的培养基及发酵条件。结果表明,以麦芽糖为碳源、蛋白胨为氮源,pH为6,培养温度在30℃时有利于F35的生长和SAM的发酵生产。最后用正交实验寻求发酵培养基成分及发酵时间的最优组合,确定各因素对SAM发酵产量的影响大小顺序为：蛋白胨>NH4Cl>麦芽糖>发酵时间>NH4H2PO4；优化的培养基配方为麦芽糖10%,蛋白胨1%,NH4H2PO4 0.4%,NH4Cl0.5%,MgS040.01%、KH2PO40.6%；发酵时间为72h。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-16
第一章 绪论  16-28
  1.1 SAM简介  16-18
    1.1.1 SAM的性质、生理功能及临床应用  16-18
    1.1.2 SAM的市场分析及应用前景  18
  1.2 SAM的制备方法  18-23
    1.2.1 化学合成法  19
    1.2.2 酶催化合成法  19-20
    1.2.3 微生物发酵法  20-23
  1.3 SAM的稳定性研究  23-24
  1.4 SAM发酵生产的代谢途径分析  24-25
    1.4.1 腺苷甲硫氨酸合成酶的调控  24
    1.4.2 胱硫醚β-合成酶的调控  24
    1.4.3 甲叉四氢叶酸还原酶的调控  24-25
    1.4.4 △-24-固醇-C-转甲基酶的调控  25
  1.5 SAM的分析测定  25-26
    1.5.1 SAM的提取  25-26
    1.5.2 SAM的测定方法  26
  1.6 论文立题背景及主要研究内容  26-28
第二章 SAM含量测定方法的研究  28-34
  2.1 实验材料  28
    2.1.1 菌株  28
    2.1.2 培养基  28
  2.2 实验方法  28-30
    2.2.1 发酵培养  28
    2.2.2 细胞破碎  28-29
    2.2.3 SAM含量测定方法  29-30
  2.3 结果与讨论  30-32
    2.3.1 细胞破碎方法的比较  30-31
    2.3.2 SAM含量测定方法的建立  31-32
  2.4 小结  32-34
第三章 单倍体分离和复合诱变  34-44
  3.1 实验材料  34-35
    3.1.1 菌株  34
    3.1.2 培养基及溶液  34-35
  3.2 实验方法  35-37
    3.2.1 生孢鉴定实验  35
    3.2.2 单倍体分离  35-36
    3.2.3 UV和DES复合诱变  36-37
  3.3 结果与讨论  37-42
    3.3.1 出发菌株的生孢鉴定  37-38
    3.3.2 R1的单倍体分离  38-40
    3.3.3 单倍体HR10的复合诱变  40-42
  3.4 小结  42-44
第四章 酿酒酵母细胞原生质体融合  44-54
  4.1 实验材料  44-45
    4.1.1 菌株  44
    4.1.2 培养基及溶液  44-45
  4.2 实验方法  45-47
    4.2.1 原生质体融合  45-47
    4.2.2 融合子SAM产量遗传稳定性研究  47
  4.3 结果与讨论  47-52
    4.3.1 原生质体融合条件的研究  47-50
    4.3.2 原生质体融合结果  50-51
    4.3.3 融合子F35遗传稳定性研究  51-52
  4.4 小结  52-54
第五章 融合子F35发酵条件优化  54-62
  5.1 实验材料  54
    5.1.1 菌株  54
    5.1.2 培养基  54
  5.2 实验方法  54-56
    5.2.1 活化培养  54
    5.2.2 发酵培养  54
    5.2.3 生物量及SAM含量的测定  54-55
    5.2.4 碳源的优化  55
    5.2.5 氮源的优化  55
    5.2.6 培养温度的影响  55
    5.2.7 pH的优化  55
    5.2.8 正交实验设计  55-56
  5.3 结果与讨论  56-59
    5.3.1 碳源的优化  56
    5.3.2 氮源的优化  56-57
    5.3.3 温度对融合子F35生产SAM的影响  57
    5.3.4 pH的优化  57-58
    5.3.5 F35发酵培养基主要成分的正交试验设计  58-59
  5.4 小结  59-62
第六章 结论  62-64
参考文献  64-68
附录  68-76
致谢  76-78
作者和导师简介  78-79
附录  79-80

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 酿酒工业 > 酿酒微生物 > 酵母（各种曲）
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