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真空冷冻干燥对乳酸菌损伤机制及关键保护技术研究

作　者: 李宝磊
导　师: 张兰威
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 乳酸菌冷冻冻干保护剂
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着乳酸菌对人体健康有益作用的不断深入研究和揭示,乳酸菌制品逐渐受到人们的青睐,发酵乳制品的消费量呈快速增长趋势,各类乳酸菌制品也层出不穷。所以研制高活力和高稳定性的发酵剂以适应我国发酵乳制品的进一步发展已经成必然。优良菌株的获得、培养方式和乳酸菌的保存工艺研究是制备浓缩发酵剂的三大技术难题,目前冷冻发酵剂和冻干发酵剂应用较为广泛,所以对乳酸菌冷冻技术和冻干技术及其机理的的研究具有重要的理论和实际意义。本论文分别对深冻发酵剂和冻干发酵剂的的关键工艺参数及保护剂配方做了研究,以保证S. thermophilus SP1.1在制作发酵剂过程中保持较高的存活率及发酵活力,对指导现实生产有很大意义。通过S. thermophilus SP1.1存活率及发酵活力指标确定了冷冻及冻干的条件,包括菌体培养的收获时间,冷冻温度、冷冻时间,冻干过程中预冻温度、预冻时间,解析干燥过程中隔板加热温度。最后确定S. thermophilus SP1.1培养时间为8h,此时菌体对冷冻及冻干抗性最强,冷冻温度为-196℃,冷冻时间为10min,添加保护剂存活率达89.3%,冻干过程中预冻温度为-196℃,预冻时间为10min,解析干燥过程中隔板加热温度为0℃。为了确定冷冻及冻干过程中β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶活力的下降会影响乳酸菌总体发酵活力的下降以及冷冻及冻干过程对乳酸菌细胞膜通透性的影响,测定了冷冻及冻干过程前后菌体β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶胞内外的酶活。数据显示,正常菌体β-半乳糖苷酶胞外酶活力为1.687 10-3U,冷冻后,添加脱脂乳菌体的胞外酶活力为9.022 10-3U,添加保护剂菌体的胞外酶活力变为6.381 10-3U;正常菌体乳酸脱氢酶胞外活力为8.84 10-3U,冷冻后,添加脱脂乳菌体乳酸脱氢酶的胞外酶活力为2.251 10-2U,添加保护剂菌体乳酸脱氢酶的胞外酶活力变为1.206 10-2U。由此可见,冷冻过程对乳酸菌细胞膜有很强的物理损伤作用,使细胞膜渗透性增加,甚至破裂,导致两种酶泄漏。冻干后,添加脱脂乳菌体的β-半乳糖苷酶胞外酶活力为1.350 10-2U,添加保护剂菌体的β-半乳糖苷酶胞外酶活力变为1.027 10-2U;添加脱脂乳菌体乳酸脱氢酶的胞外酶活力为9.646 10-3U,添加保护剂菌体乳酸脱氢酶的胞外酶活力变为6.833 10-2U。可见,冻干过程对乳酸菌细胞膜损伤更为严重。干燥阶段,由于细胞膜磷脂分子间水分的逐渐脱除,细胞膜有可能发生相转变,复水后相转变再次发生,磷脂分子间可能出现空位,渗透性加大,导致两种酶泄漏。数据也显示经过冷冻处理后,两种酶的总酶活都有所下降,可认为两种酶酶活的降低是导致S. thermophilus SP1.1冷冻和冻干处理后发酵活力降低的原因之一。通过保护剂的选择和正交实验,确定适合S. thermophilus SP1.1的最佳冷冻保护剂配方和冻干保护剂配方。冷冻保护剂配方为原冷冻保护剂配方中用蔗糖替代海藻糖用量一半再加上甘露醇5%、三聚磷酸钠1%、透明质酸钠0.01%、组氨酸1.5%,保护剂的最佳pH值为7.0,冷冻存活率达94.3%。冻干保护剂配方为原保护剂加上组氨酸1.5%、三聚磷酸钠1.5%、HASS0.02%、0谷氨酸钠.5%,保护剂的最佳pH值为6.0,冻干存活率达86.6%。通过红外光谱分析,推测透明质酸钠的保护机制为与细胞膜通过氢键结合,在冷冻和干燥过程中起到维持细胞膜结构和功能的作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章绪论  11-21
  1.1 课题背景及研究的目的和意义  11
  1.2 乳酸菌发酵剂研究的发展概况  11-20
    1.2.1 乳酸菌活菌制剂的概述  11-12
    1.2.2 酸奶发酵剂的概述  12-13
    1.2.3 真空冷冻干燥技术  13
    1.2.4 冷冻干燥技术制备乳酸菌发酵剂  13-14
    1.2.5 真空冷冻干燥对乳酸菌细胞的损伤  14-16
    1.2.6 乳酸菌冷冻干燥工艺  16-17
    1.2.7 乳酸菌冷冻干燥保护剂  17-19
    1.2.8 保护剂对乳酸菌的冷冻及冻干保护机理  19-20
  1.3 本课题研究内容  20-21
第2章材料与方法  21-31
  2.1 实验试剂及仪器  21-22
  2.2 实验仪器及设备  22-23
  2.3 实验菌株  23
  2.4 实验方法  23-26
    2.4.1 菌种活化与传代  23-24
    2.4.2 活菌计数  24
    2.4.3 乳酸菌冷冻及冻干发酵剂制作流程  24
    2.4.4 β-半乳糖苷酶活力测定方法  24-25
    2.4.5 乳酸脱氢酶的活力测定方法  25
    2.4.6 S. thermophilus SP1.1 发酵活力检测  25-26
    2.4.7 菌体破壁率的测定  26
    2.4.8 菌体存活率的测定  26
    2.4.9 红外光谱检测  26
  2.5 实验步骤  26-31
    2.5.1 S. thermophilus SP1.1 冷冻及冻干工艺的优化  26-27
    2.5.2 冷冻及冻干对S. thermophilus SP1.1 发酵活力的影响  27-28
    2.5.3 S.thermophilus SP1.1 冷冻及冻干保护  28-29
    2.5.4 透明质酸钠在 S. thermophilus SP1.1 真空冷冻干燥过程中的保护机制  29-31
第3章 SP1.1 冷冻和冻干工艺的优化  31-41
  3.1 不同生长时期对菌体抗冷冻及冻干的影响  31-34
    3.1.1 乳酸球菌生长曲线的绘制  31-32
    3.1.2 不同生长时期的菌体抗冷冻能力及抗冷冻干燥能力的研究  32-34
  3.2 冷冻条件对菌体存活率及活性的影响  34-36
    3.2.1 冷冻温度的确定  34-35
    3.2.2 冷冻时间的确定  35-36
  3.3 真空冷冻干燥对菌体活性的影响  36-40
    3.3.1 预冻温度的确定  36-37
    3.3.2 预冻时间的确定  37-39
    3.3.3 解析干燥过程中隔板温度的确定  39-40
  3.4 本章小结  40-41
第4章冷冻及冻干对SP1.1 发酵活力的影响  41-45
  4.1 S. thermophilus SP1.1 破壁过程中溶菌酶加入量的确定  41-42
  4.2 冷冻及冻干过程中β-半乳糖苷酶活力变化  42-43
  4.3 冷冻及冻干过程中乳酸脱氢酶活力变化  43-44
  4.4 本章小结  44-45
第5章 SP1.1 的冷冻及冻干保护  45-60
  5.1 海藻糖-蔗糖溶液与单独海藻糖溶液保护效果研究  45-46
  5.2 冷冻保护剂配方的优化  46-51
    5.2.1 保护剂的选择  46-48
    5.2.2 正交试验优化冷冻保护剂配方  48-49
    5.2.3 正交优化冷冻保护剂配方的验证试验  49
    5.2.4 保护剂pH 值对S. thermophilus SP1.1 冷冻存活率及活性的影响  49-50
    5.2.5 优化后保护剂对β-gal 和LDH 在冷冻过程中活力的改善作用  50-51
  5.3 冻干保护剂配方的优化  51-56
    5.3.1 保护剂的选择  51-53
    5.3.2 正交试验优化冻干保护剂配方  53-54
    5.3.3 正交优化冻干保护剂配方的验证试验  54
    5.3.4 保护剂pH 值对S. thermophilus SP1.1 冻干存活率的影响  54-55
    5.3.5 优化后保护剂对β-gal 和LDH 在冻干过程中活力的改善作用  55-56
  5.4 透明质酸钠在S. thermophilus SP1.1 冻干过程中的保护机制  56-58
  5.5 本章小结  58-60
结论  60-62
参考文献  62-67
致谢  67

真空冷冻干燥对乳酸菌损伤机制及关键保护技术研究

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