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犬细小病毒的分离鉴定与生物学特性研究

作　者: 周云朵
导　师: 刘正飞
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬细小病毒分离电镜动物回归实验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

犬细小病毒病在1978年成为全球性疾病,并且从那以后在世界各地呈地方性流行(Parrish,1990; Truyen,1995)。本研究旨在获得华中地区的犬细小病毒分离株并对其基因型分型、流行病学、生物学特性及致病力进行探讨。从武汉部分宠物医院采集胶体金初检阳性的50份可疑病料,用猫肾细胞(F81)进行病毒分离,并进行电镜观察。根据犬细小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,设计一对引物,用来鉴定CPV；参考文献(kapil et al.,2007)合成另一对引物,用来调查犬细小病毒的不同基因型的流行状况；参考CPV全序列设计扩增VP2全长的引物,并进行遗传进化分析。为了得到分离株的阅读框(ORF),又设计了四对引物。在细胞上对最先分离到的5株病毒进行空斑纯化,进行一步法生长曲线测定。最后对这5株病毒都进行动物回归实验。细胞传代结果表明,从50份病料中获得了34株犬细小病毒。PCR扩增结果表明获得390bp、583bp和1755bp三个片段。与Genbank发布的CPV-2比对后,390bp的测序结果表明我们获得的28株病毒是犬细小病毒而583bp测序的结果表明所获得的28株病毒中,有30株属于2a型,4株属于2b型。对VP2全序列进行的遗传进化分析表明,我们得到的分离株与最早分离的毒株距离最远,与欧洲、美洲的毒株距离较远,与中国分离株较近。空斑纯化及生长曲线绘制结果表明分离毒株增殖滴度可达105.5PFU/mL。通过比较同步接毒和非同步接毒所绘制的生长曲线发现,在接毒的前12小时内略微有点区别,细胞传代8小时后进行接毒的生长曲线一开始有下降趋势,接着又慢慢开始上升,而同步接毒的生长曲线从一开始接毒就是上升趋势。在一定条件下都可以凝集猪的红细胞,并且该凝集可以被犬细小病毒单克隆抗体特异性阻断。电镜观察结果表明,感染细胞的线粒体肿胀。通过PCR,我们得到了毒株3和毒株10的完整的ORFs。动物回归试验结果表明犬只都能表现不同程度的发病状况,如呕吐、排血便等。在细胞上检测,发现有排毒现象,最高排毒量可达1025/0.1mL。大体解剖发现肠管有坏死、心肌变薄。将病变的心脏制作切片观察,结果表明心肌细胞变性、坏死。本研究结果表明在华中地区,CPV-2a占据主导地位,这为我们以后的预防及治疗提供一定的理论依据；而相关的分离鉴定实验和生物特性研究则对进一步研究CPV-2的分子生物学和分子致病机理提供材料。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
缩略语表(Abbreviation)  8-10
第1章文献综述  10-19
  1.1 犬细小病毒病及其危害  10-11
  1.2 犬细小病毒的病原学及其作用机制  11-13
    1.2.1 犬细小病毒的病原学  11-12
    1.2.2 病毒的致病机理及在细胞内的作用途径  12-13
  1.3 犬细小病毒的进化与分型依据  13-14
  1.4 犬细小病毒病的诊断及防治  14-18
    1.4.1 犬细小病毒病的诊断  14-16
    1.4.2 犬细小病毒病的防治  16-18
  1.5 本研究的目的和意义  18-19
第二章材料与方法  19-34
  2.1 实验材料  19-23
    2.1.1 病料、细胞、菌种、载体  19
    2.1.2 主要药品与试剂  19-21
    2.1.3 主要培养基及其配制  21-22
    2.1.4 缓冲液  22
    2.1.5 实验器材  22
    2.1.6 实验动物  22-23
  2.2 实验方法  23-34
    2.2.1 犬细小病毒的分离  23
    2.2.2 犬细小病毒的鉴定  23-27
    2.2.3 空斑试验及生长曲线绘制  27-29
    2.2.4 血凝(HA)与血凝抑制实验(HI)  29-30
    2.2.5 透射电镜观察  30
    2.2.6 犬细小病毒ORFs的扩增  30-32
    2.2.7 动物回归试验  32-34
第三章结果与分析  34-49
  3.1 病毒分离结果  34
  3.2 病毒鉴定结果  34-39
    3.2.1 鉴定及其分型结果  34-35
    3.2.2 遗传进化分析  35-39
  3.3 空斑试验及生长曲线绘制  39-40
    3.3.1 空斑试验结果  39
    3.3.2 空斑纯化结果  39-40
    3.3.3 生长曲线的绘制  40
  3.4 HA和HI试验  40-41
  3.5 超微结构观察  41-42
  3.6 CPV ORFs扩增结果  42-44
    3.6.1 PCR扩增结果  42
    3.6.2 测序结果及比对分析  42-44
  3.7 动物回归试验结果  44-49
    3.7.1 体温测量  45-46
    3.7.2 体重测量  46
    3.7.3 体外排毒  46-47
    3.7.4 临床病理变化  47-48
    3.7.5 组织病理变化  48-49
第四章讨论与结论  49-53
  4.1 讨论  49-52
    4.1.1 病毒的分离鉴定  49-50
    4.1.2 分子流行病学调查  50
    4.1.3 CPV ORF的扩增  50-51
    4.1.4 生物学特性研究  51-52
  4.2 结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
附录  61-68

犬细小病毒的分离鉴定与生物学特性研究

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