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双酚A对斑马鱼的毒性以及内分泌干扰作用

作　者: 曹娜
导　师: 魏华
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 内分泌干扰物双酚A 斑马鱼急性毒性肝脏内分泌干扰效应
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

为了阐明内分泌干扰物双酚A（BPA）对水生动物的毒理作用机制、内分泌干扰作用及其机制。研究了BPA对斑马鱼急性毒性作用,BPA对斑马鱼的肝脏损伤以及氧化胁迫作用,BPA对斑马鱼的性腺组织损伤以及生殖作用的影响,BPA对斑马鱼的肝脏Esr1（ERα）、AhR2以及VTG mRNA表达的影响。结果表明:BPA对斑马鱼具有急性毒性作用,BPA暴露会对斑马鱼的肝脏、性腺产生组织损伤作用,BPA影响斑马鱼的生殖作用;BPA对斑马鱼具有内分泌干扰作用。1.斑马鱼的BPA急性毒性实验BPA曝毒6 h,高浓度组斑马鱼出现游动缓慢,身体逐渐失去平衡,侧游,仰游,沉底,呼吸微弱等现象。曝毒12 h,高浓度组斑马鱼出现死亡现象,死亡个体胸鳍,腹部出现暗红色异常。BPA对斑马鱼的96h半致死浓度为6.3 mg L^-1,斑马鱼对BPA较为敏感,安全浓度为0.63 mg L^-1。2.BPA对斑马鱼的肝脏损伤和氧化胁迫作用为了进一步了解BPA对斑马鱼的毒性以及致毒机理,对斑马鱼进行BPA暴露,定时取斑马鱼肝脏用于检测BPA对斑马鱼的肝脏损伤和氧化胁迫作用。96 h暴露对斑马鱼的肝脏产生了浓度依赖性损伤。在0.2 mg L^-1亚致死浓度BPA组中,暴露96 h后,斑马鱼肝脏受到轻微损伤;在2 mg L^-1亚致死浓度BPA组中,暴露96 h,斑马鱼的肝脏组织受到了一定损伤,细胞核萎缩变形,细胞肿胀,核固缩;在6.1 mg L^-1BPA组中暴露96 h,斑马鱼肝脏产生了极大的损伤,细胞空泡化,大面积的组织坏死,空洞产生。暴露6h各个浓度组SOD活力均表现为激活,活力水平高于对照组,其中0.2和2 mg L^-1浓度组激活效应不明显（P>0.05）,6.1 mg L^-1浓度组SOD活力显著增强（P<0.05）。暴露12h后,处理组SOD活力与对照组相比没有显著变化。暴露24小时,处理组SOD活力均低于对照组。以上结果表明,96h亚致死浓度情况下,SOD活力与对照组相差不大（P>0.05）;高浓度组(6 mg L^-1BPA)处理后,SOD活力水平在6h显著升高,随着暴露时间的延长逐渐恢复至正常水平。亚致死浓度组(0.1,0.6 mg L^-1)BPA处理后,48h检测结果显示GPX活力被诱导（P<0.05）;高浓度组(6 mg L^-1BPA)处理后,斑马鱼肝脏GPX活力被诱导。BPA对斑马鱼肝脏具有靶器官毒性。3.BPA对斑马鱼的性腺损伤为了了解BPA对斑马鱼的性腺损伤和损伤机制,对斑马鱼进行了不同浓度BPA暴露96h。在高浓度组(6.3 mg L^-1),斑马鱼精巢结构损伤,卵泡萎缩严重（闭锁率35%）;在0.2 mg L^-1亚致死浓度BPA组中,性腺组织结构没有明显损伤,卵巢中处于第Ⅲ时相晚期和第Ⅳ时相配子数比率增加,单个卵母细胞直径增加（P<0.05）;在2 mg L^-1亚致死浓度BPA组中,暴露96 h,斑马鱼性腺组织受损不明显,卵巢中第Ⅲ时相晚期第Ⅳ时相配子数比率有所增加;在6.1 mg L^-1BPA组中,暴露96 h,斑马鱼精巢组织结构受到一定损伤,卵巢中发现大量细胞萎缩现象;BPA对性腺作用值得进一步研究。精巢精子头计数结果显示,低浓度(2 mg L^-1)和中浓度(6 mg L^-1)的BPA暴露后,斑马鱼每克精巢精子头数目先增加后减少,而高浓度(8 mg L^-1)组表现为显著抑制作用,每克精巢精子头数目减少。精子头计数结果与精巢组织切片观察结果一致。4.BPA在斑马鱼中的内分泌干扰作用为了探讨双酚A对斑马鱼肝脏Esr1、AhR2以及VTG1 mRNA表达的影响,从而探明BPA对斑马鱼产生内分泌干扰作用可能的作用机制,在96h亚致死浓度范围内设置一个浓度组(2 mg L^-1)对雄性斑马鱼进行曝毒实验。结果表明:雄性斑马鱼BPA暴露12h,Esr1和VTG1被显著诱导,与曝毒0h相比差异显著（P<0.05）。雄性斑马鱼BPA暴露24小时,Esr1和VTG1mRNA相对表达量依旧保持相当高的水平,与曝毒0h相比差异显著（P<0.05）。暴露48h,Esr1的相对表达量继续升高。暴露72h,Esr1和VTG1mRNA相对表达量低于暴露12,24和48h,与0h相比没有显著差异（P>0.05）。BPA暴露96小时中,AhR2在48h被诱导,mRNA相对表达量为0h的3.22倍。暴露过程中,Esr1和VTG1mRNA相对表达量变化一致。本实验选用的BPA染毒浓度为亚致死浓度2 mg L^-1,证明BPA对雄性斑马鱼的Esr1和VTG1mRNA诱导能力较强。对AhR2具有一定的诱导作用,但是诱导能力较弱。结果表明BPA对斑马鱼的内分泌干扰作用存在多途径过程。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-12
引言  12-22
  1.1 环境内分泌干扰物的研究现状  12-14
    1.1.1 环境内分泌干扰物的定义  12-13
    1.1.2 环境内分泌干扰物分类  13
    1.1.3 环境内分泌干扰物的来源  13-14
  1.3 环境激素雌激素效应的研究现状  14-18
    1.3.1 雌激素  14-15
    1.3.2 雌激素应答元件  15-16
      1.3.2.1 卵黄蛋白原（Vitellogenin）  15-16
      1.3.2.2 卵壳蛋白（choriogenin proteins）  16
    1.3.3 环境激素作用机制研究  16-17
    1.3.4 环境激素的研究方法  17-18
  1.4 环境激素双酚A（BPA）  18-20
  1.5 斑马鱼应用于生殖毒理研究  20
  1.6 本研究的内容与意义  20-22
第一章双酚A 对斑马鱼的急性毒性作用  22-26
  1.1 材料与方法  23-24
    1.1.1 试剂和仪器  23
    1.1.2 试验材料  23
    1.1.3 试验方法  23
    1.1.4 数据处理  23-24
  1.2 结果与分析  24
    1.2.1 急性毒性  24
  1.3 讨论  24-26
第二章双酚A 对斑马鱼肝脏的组织损伤和氧化胁迫作用  26-34
  2.1 材料与方法  27-28
    2.1.1 试剂和仪器  27
    2.1.2 试验材料  27
    2.1.3 试验方法  27-28
    2.1.4 数据处理  28
  2.2 实验结果  28-31
    2.2.1 BPA 暴露对斑马鱼肝脏的影响  28-30
    2.2.2 BPA 对斑马鱼肝脏SOD 和GSH-PX 的影响  30-31
  2.3 讨论  31-34
    2.3.1 肝脏病理学  31-32
    2.3.2 BPA 对斑马鱼的肝脏氧化胁迫作用  32-34
第三章双酚A 对斑马鱼性腺的组织损伤作用  34-43
  3.1 材料与方法  34-36
    3.1.1 试剂和仪器  34-35
    3.1.2 试验材料  35
    3.1.3 试验方法  35-36
    3.1.4 数据处理  36
  3.2 实验结果  36-40
    3.2.1 BPA 对斑马鱼性腺组织学的影响  36-39
    3.2.2 BPA 对斑马鱼生精作用的影响  39-40
  3.3 讨论  40-43
    3.3.1 精巢变化和雄性配子发生  40-41
    3.3.2 卵巢变化和雌性配子发生  41-42
    3.3.3 BPA 对斑马鱼生精作用的影响  42-43
第四章双酚A 对斑马鱼肝脏Esr1(ERα)、AhR2 以及VTG mRNA 表达的影响  43-55
  4.1 材料与方法  44-47
    4.1.1 仪器与药品  44
    4.1.2 试验材料  44
    4.1.3 试验方法  44-47
  4.2 数据分析  47
  4.3 实验结果  47-51
    4.3.1 总RNA 提取完整性和纯度  47-51
  4.4 讨论  51-55
    4.4.1 BPA 对Esr 1 mRNA 表达的影响  51-53
    4.4.2 BPA 对AhR 2 mRNA 表达的影响  53-54
    4.4.3 BPA 对 VTG1 mRNA 表达的影响  54-55
结束语  55-56
参考文献  56-69
致谢  69

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