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贻贝蛋白酶解制备活性肽的工艺研究及活性评价

作　者: 马佳卉
导　师: 曲有乐; 王斌
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 贻贝酶解工艺活性肽抗氧化活性血管生成抑制活性
分类号: TQ936.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文以紫贻贝和厚壳贻贝为实验材料，采用酶解、超滤、离子交换层析、凝胶渗透层析和高效液相色谱法等分离纯化手段，得到了贻贝活性肽，并对贻贝蛋白的酶解工艺、活性肽的制备工艺及其抗氧化和血管生成抑制活性进行了研究。首先采用正交实验法，以羟自由基清除率为评价指标，分别研究了厚壳贻贝中性蛋白酶酶解工艺和紫贻贝碱性蛋白酶酶解工艺。结果如下：厚壳贻贝中性蛋白酶最佳工艺为酶解时间3h，酶解温度60℃，料液比1:2，加酶量3%；紫贻贝碱性蛋白酶最佳工艺为酶解温度45℃，酶解时间3h，pH8.0，加酶量3%，料液比1:1。在最佳条件下，10mg/mL厚壳贻贝和紫贻贝水解物溶液的羟自由基清除率分别为66.82%和80.97%。分别将厚壳贻贝中性蛋白酶酶解物(MCNH)、紫贻贝碱性蛋白酶酶解物(MEAH)、紫贻贝木瓜蛋白酶酶解物(MEPH)和紫贻贝中性蛋白酶酶解物(MENH)通过截留分子量为10kDa和3kDa的超滤膜进行超滤分段，并分别测定其浓度10mg/mL时羟自由基清除率，选取清除率高的部分，即MCNH-1、MEAH-1、MEPH-1、MENH-2通过DEAE-52阴离子交换色谱进一步分离，选取羟自由基清除率高的部分即MCNH-1-1、MEAH-1-4、MEPH-1-6、MENH-2-1经Sephadex G-15进一步分离，对所得组分的羟自由基清除率进行评价；将紫贻贝中性蛋白酶酶解产物经超滤后得到的MW<3kDa的部分(MENH-3)直接经Sephadex G-15分离，得率最高的组分（MENH-3-3）经反相高效液相色谱Zorbax C18纯化后得到了纯度较高的活性肽（MNH），其分子量为574.68Da。随着浓度递增，MNH对羟自由基清除率也增加，浓度在5mg/mL时对羟自由基清除率为23.49%。将以上各步骤中得到的抗氧化活性较高的部分，包括粗蛋白（MCNH-1、MEAH-1、MEPH-1、MENH-2、MENH-3）、离子峰（MCNH-1-1、MEAH-1-4、MEPH-1-6、MENH-2-1）、凝胶峰（MCNH-1-1-2、MEAH-1-4-1、MEPH-1-6-1、MENH-2-1-1、MENH-3-3）、不同浓度MNH进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制实验，结果表明：各样品对鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成均有显著抑制作用，其中碱性蛋白酶酶解紫贻贝得到的粗蛋白、离子峰和凝胶峰，对鸡胚绒毛尿囊膜血管的抑制略优于其他蛋白酶酶解产物。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章前言  12-14
第二章海洋贝类活性肽研究进展综述  14-24
  2.1 抗菌活性肽  14-16
  2.2 抗高血压活性肽  16
  2.3 抗氧化活性肽  16-19
  2.4 抗肿瘤活性肽  19-21
  2.5 其他活性肽  21-23
  2.6 展望与结语  23-24
第三章贻贝酶解工艺研究  24-35
  3.1 材料与仪器  24
    3.1.1 材料  24
    3.1.2 主要仪器  24
  3.2 实验方法  24-26
    3.2.1 最适酶的选择  24-25
    3.2.2 抗氧化活性测定  25
    3.2.3 厚壳贻贝中性蛋白酶酶解工艺优化  25
    3.2.4 紫贻贝碱性蛋白酶酶解工艺优化  25-26
  3.3 结果与分析  26-34
    3.3.1 最适酶的选择  26-27
    3.3.2 厚壳贻贝中性蛋白酶酶解工艺优化  27-30
    3.3.3 紫贻贝碱性蛋白酶酶解工艺优化  30-34
  3.4 小结  34-35
第四章贻贝酶解多肽制备工艺研究  35-53
  4.1 试剂与仪器  35
    4.1.1 试剂  35
    4.1.2 仪器  35
  4.2 实验方法  35-38
    4.2.1 厚壳贻贝中性蛋白酶酶解多肽制备工艺研究  35-36
    4.2.2 紫贻贝碱性蛋白酶酶解多肽制备工艺研究  36-37
    4.2.3 紫贻贝木瓜蛋白酶酶解多肽制备工艺研究  37
    4.2.4 紫贻贝中性蛋白酶酶解多肽制备工艺研究  37-38
  4.3 实验结果  38-51
    4.3.1 厚壳贻贝中性蛋白酶酶解多肽制备工艺结果  38-40
    4.3.2 紫贻贝碱性蛋白酶酶解多肽制备工艺结果  40-43
    4.3.3 紫贻贝木瓜蛋白酶酶解多肽制备工艺结果  43-45
    4.3.4 紫贻贝中性蛋白酶酶解多肽制备工艺结果  45-51
  4.4 小结  51-53
第五章贻贝酶解多肽活性研究  53-65
  5.1 材料与仪器  53
    5.1.1 材料  53
    5.1.2 仪器  53
  5.2 实验方法  53-54
    5.2.1 待测样品的制备  53-54
    5.2.2 蛋胚的孵育  54
    5.2.3 蛋胚气室的去除  54
    5.2.4 加样  54
    5.2.5 观察  54
  5.3 实验结果  54-64
    5.3.1 粗蛋白抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的测定  54-57
    5.3.2 离子峰抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的测定  57-59
    5.3.3 凝胶峰抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的测定  59-62
    5.3.4 MNH 抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的测定  62-64
  5.4 小结  64-65
第六章结语与展望  65-67
  6.1 结语  65
  6.2 展望  65-67
参考文献  67-73
致谢  73-74
在读期间发表的学术论文及研究成果  74

贻贝蛋白酶解制备活性肽的工艺研究及活性评价

内容摘要

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