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软枣猕猴桃多肽制备、纯化及其生物活性研究

作　者: 许金光
导　师: 刘长江
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 软枣猕猴桃 多肽 制备 生物活性
分类号: TQ914
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


东北野生软枣猕猴桃是一种珍稀的野果资源，软枣猕猴桃（Actinidia arguta Sieb.etZucc）为猕猴桃科猕猴桃属，又名软枣子、藤枣、藤瓜和猕猴梨。分布在我国的华北、东北、西北及长江流域，其中东北南部长白山脉一带山区较多。软枣猕猴桃的根、茎、叶及果实均可以入药。根味淡、微涩、有健胃、清热、利湿等功能,茎可以做手杖及烟袋杆,叶中含有大量叶绿素、胡萝卜素、钾、钠等物质，其果实含有SOD、氨基酸、糖类等功能活性成分，具有生津润肺、滋补强身等作用，对高血脂、高血压、心绞痛等有一定的疗效。多肽是目前研究的一个热点，目前，国内外对软枣猕猴桃果实的系统研究尚处于起步阶段，见诸报道的仅有果实中的SOD、氨基酸、酶的研究，尚无对其中的蛋白及多肽进行系统研究。本研究为东北野生软枣猕猴桃的综合开发利用奠定理论基础，具有重要的科研价值。本文对软枣猕猴桃多肽的制备、纯化及生物活性进行了系统研究，以提取率为考察指标，以碱法为提取方法，通过响应面分析确定了总蛋白的最佳提取条件；以蛋白质水解度为指标，以响应面法为手段，确定了酶法制备软枣猕猴桃多肽的最佳条件。接着，采用了超滤、Sephadex G-25凝胶色谱、DEAE-32离子交换层析及RP-HPLC方法对软枣猕猴桃多肽进行了分离纯化，通过体内、体外试验综合评价软枣猕猴桃多肽的抗氧化能力；并用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定了纯度，对其稳定性进行了研究。在试验中，通过抑菌谱的测定，评价了软枣猕猴桃多肽的抑菌能力；通过淋巴细胞转化试验、半数溶血值（HC50）的测定、吞噬指数、免疫器官指数和小鼠足趾肿胀度的测定研究软枣猕猴桃多肽的免疫增强功能。以多孔淀粉为芯材，分别采用明胶和β-环状糊精对软枣猕猴桃多肽进行包埋，研究了超声时间、超声温度、超声功率对包埋效果的影响，并模拟了微胶囊在体内环境下的释放。在对软枣猕猴桃多肽的安全性评价上，采用了急性毒理试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验、彗星试验等方法，明确了软枣猕猴桃多肽的安全性。本文主要研究结论如下：1.软枣猕猴桃中鲜果中粗蛋白含为1.25%（鲜果）,干果的含量为7.5%，碱法提取软枣猕猴桃总蛋白最佳条件为：料液比为1：19，提取液pH为7.9，温度50℃，提取时间为2.3h，蛋白质的提取率可达53.23%。2、以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶为筛选范围，以水解度为考察指标，对软枣猕猴桃蛋白进行酶解，结果表明胰蛋白酶的水解效果优于其他两种酶，通过响应面法进行优化，最佳酶解工艺理论条件为：pH7.14，酶活添加量为7500u/g料，温度56.43℃，底物浓度1.86%，在此条件下对软枣猕猴桃蛋白进行水解，水解度为23.32%，多肽含量为60.36，经氨基酸自动分析仪分析，酶解物中含有17种氨基酸，其中含有7种人体必需氨基酸。3.对软枣猕猴桃多肽进行超滤，研究了较优的条件为：操作压力0.06Mpa,温度30℃，流速2.25ml/s,浓缩倍数2倍，操作时间4min。以10K Da为界点，将软枣猕猴桃多肽分成两个组分，10KDa以下的为组分Ⅰ，10KDa以上的为组分Ⅱ，结果表明两个组分均具有抗氧化性，且抗氧化性由于Vc,但组分Ⅰ的抗氧化性较好。采用Sephadex G-25对组分Ⅰ进行层析，获得3个分离峰，其中第3个峰抗氧化活性最强；采用DEAE-32纤维素对第三个峰分离，获得4个峰，其中第4个峰的抗氧化活性最强；采用RT-HPLC对第4个峰进行分离，分理出两个主峰，其中第1个峰具有较高的抗氧化活性，对超氧阴离子和自由基的清除能力分别达76.1%和85.9%，对其进一步进行醋酸纤维薄膜试验，测得纯化后的多肽含量可达98.36%。4、抑菌试验表明，软枣猕猴桃多肽对细菌具有广谱抑菌效果，对酵母与霉菌未见明显抑制作用。5、免疫试验表明，软枣猕猴桃多肽能够延长小鼠负重游泳时间、增加小鼠肝糖原储备量、增强动物运动耐力、缓解动物体力疲劳的作用。6、稳定性试验表明，软枣猕猴桃多肽在pH6-8范围内较稳定，温度越高，稳定性越差。丙三醇、蔗糖、乳糖、甘露醇对软枣猕猴桃多肽的热变性有明显的保护作用，其中8%的丙三醇保护效果最好。在人工模拟胃液消化试验中，胃蛋白酶和胰蛋白酶均能降低软枣猕猴桃多肽的抗氧化活性，其中胃蛋白酶的作用更为明显。7、对软枣猕猴桃多肽进行微胶囊处理，结果表明，以多孔淀粉为芯材，β-环状糊精为壁材效果较好，其抗氧化性保持较好，且不易吸潮。8、安全性试验表明：软枣猕猴桃多肽小鼠急性毒性试验，LD50>20g/kg，属无毒级。骨髓细胞微核试验、Ames试验、睾丸精母细胞染色体畸变试验、彗星试验结果均为阴性，表明软枣猕猴桃多肽是一种无毒物质，初步证明软枣猕猴桃多肽作为保健食品的食用安全性。

全文目录


摘要  11-14
ABSTRACT  14-17
第一章 绪论  17-32
  1.1 前言  17-18
  1.2 软枣猕猴桃的研究现状  18-22
    1.2.1 软枣猕猴桃的化学成分研究  18-19
    1.2.2 软枣猕猴桃的药理活性及生理功能  19-21
    1.2.3 软枣猕猴桃在食品加工中的应用  21-22
  1.3 生物活性肽的功能特性  22-31
    1.3.1 生物活性肽的制备方法  22-24
    1.3.2 生物活性肽的分类  24-28
    1.3.3 生物活性肽的分离纯化  28-30
    1.3.4 生物活性肽的应用  30-31
  1.4 本研究的目的、意义及主要内容  31-32
    1.4.1 目的、意义  31
    1.4.2 主要内容  31-32
第二章 软枣猕猴桃蛋白提取工艺研究  32-43
  2.1 材料与方法  32-34
    2.1.1 原料  32
    2.1.2 试剂  32
    2.1.3 仪器设备  32
    2.1.4 实验方法  32-34
  2.2 结果与分析  34-41
    2.2.1 软枣猕猴桃基本组分测定结果  34-35
    2.2.2 考马斯亮蓝 G-250 法标准曲线的绘制  35
    2.2.3 软枣猕猴桃蛋白等电点测定  35
    2.2.4 影响软枣猕猴桃蛋白提取率的单因素试验  35-37
    2.2.5 应用响应面法进行提取工艺的优化  37-41
  2.3 讨论  41-42
  2.4 小结  42-43
第三章 软枣猕猴桃多肽的制备  43-55
  3.1 材料与方法  43-46
    3.1.1 原料  43
    3.1.2 试剂  43-44
    3.1.3 仪器设备  44
    3.1.4 实验方法  44-46
  3.2 结果与分析  46-53
    3.2.1 酶的筛选  46-47
    3.2.2 单因素实验结果与分析  47-49
    3.2.3 二次通用旋转组合设计试验结果及响应面分析  49
    3.2.4 提取率的方差分析  49-50
    3.2.5 响应面分析  50-52
    3.2.6 最佳工艺参数  52
    3.2.7 软枣猕猴桃蛋白酶解物蛋白含量及氨基酸组成分析  52-53
  3.3 讨论  53
  3.4 小结  53-55
第四章 软枣猕猴桃多肽的分离纯化及抗氧化性研究  55-74
  4.1 材料与方法  55-60
    4.1.1 材料与试剂  55-56
    4.1.2 主要仪器  56
    4.1.3 试验方法  56-60
  4.2 结果与分析  60-70
    4.2.1 分离纯化结果分析  60-65
    4.2.2 体内试验结果分析  65-70
  4.3 讨论  70-72
    4.3.1 关于超滤法对软枣猕猴桃多肽纯化的讨论  70
    4.3.2 关于层析对软枣猕猴桃多肽纯化的讨论  70-71
    4.3.3 关于软枣猕猴桃抗氧化性的讨论  71-72
  4.4 小结  72-74
第五章 软枣猕猴桃多肽抑菌活性研究  74-81
  5.1 材料与方法  74-76
    5.1.1 原料  74
    5.1.2 试剂  74
    5.1.3 仪器设备  74
    5.1.4 培养基  74-75
    5.1.5 实验方法  75-76
  5.2 结果与分析  76-79
    5.2.1 软枣猕猴桃多肽抑菌谱的测定  76
    5.2.2 软枣猕猴桃多肽 MIC 的测定  76-78
    5.2.3 介质 pH 对软枣猕猴桃多肽抑菌活性的影响  78
    5.2.4 温度对软枣猕猴桃多肽抑菌活性的影响  78-79
    5.2.5 无机盐对软枣猕猴桃多肽抑菌活性的影响  79
  5.3 小结  79-81
第六章 软枣猕猴桃多肽免疫活性作用研究  81-91
  6.1 材料与方法  81-85
    6.1.1 材料与试剂  81
    6.1.2 主要仪器  81
    6.1.3 试验方法  81-85
  6.2 结果与分析  85-88
    6.2.1 增强小鼠机体免疫力研究  85-88
    6.2.2 抗疲劳作用研究  88
  6.3 讨论  88-90
    6.3.1 软枣猕猴桃多肽调节机体免疫功能机理的讨论  88-89
    6.3.2 软枣猕猴桃多肽抗疲劳机制探讨  89-90
  6.4 小结  90-91
第七章 软枣猕猴桃多肽的稳定性研究  91-99
  7.1 材料与方法  91-92
    7.1.1 材料与试剂  91
    7.1.2 主要仪器  91
    7.1.3 试验方法  91-92
  7.2 结果与分析  92-97
    7.2.1 温度对软枣猕猴桃多肽溶液热稳定性的影响  92-93
    7.2.2 pH 值对软枣猕猴桃多肽溶液热稳定性的影响  93-94
    7.2.3 pH 值对软枣猕猴桃多肽溶液酸碱稳定性的影响  94
    7.2.4 利用保护剂提高软枣猕猴桃多肽溶液热稳定性的研究  94-96
    7.2.5 软枣猕猴桃多肽在消化系统中稳定性的研究  96-97
  7.3 讨论  97
  7.4 小结  97-99
第八章 软枣猕猴桃多肽的微胶囊技术的研究  99-119
  8.1 材料与方法  99-101
    8.1.1 材料与试剂  99
    8.1.2 主要仪器  99-100
    8.1.3 试验方法  100-101
  8.2 结果与分析  101-115
    8.2.1 微胶囊技术研究  101-113
    8.2.2 微胶囊的体外释放试验  113-114
    8.2.3 抗氧化性的比较  114
    8.2.4 微胶囊与软枣猕猴桃多肽原样吸湿性的比较  114-115
  8.3 讨论  115-117
    8.3.1 几种不同包埋方法所获得的微胶囊的比较  115-116
    8.3.2 关于多孔淀粉包埋软枣猕猴桃多肽的讨论  116
    8.3.3 多孔淀粉与环糊精的比较  116-117
    8.3.4 关于微胶囊缓释作用的讨论  117
  8.4 结论  117-119
第九章 软枣猕猴桃多肽的安全性评价  119-133
  9.1 材料与方法  119-127
    9.1.1 材料与试剂  119-120
    9.1.2 主要仪器  120
    9.1.3 试验方法  120-127
  9.2 结果与分析  127-130
    9.2.1 急性毒性试验  127
    9.2.2 Ames 试验  127-128
    9.2.3 微核试验  128-129
    9.2.4 小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验  129
    9.2.5 彗星试验  129-130
  9.3 讨论  130-132
  9.4 小结  132-133
参考文献  133-144
致谢  144-145
攻读博士学位期间发表文章  145-146

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 农产物化学加工工业 > 化学加工过程及设备
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