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两种产卡拉胶红藻原生质体制备与枝段培养

作　者: 李俊鹏
导　师: 刘建国
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 长心卡帕藻细齿麒麟菜篮子鱼内脏酶解液原生质体组织培养
分类号: X55
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

长心卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）和细齿麒麟菜（Eucheuma denticulatum）是工业上生产卡拉胶的重要原料，也可作为生产工业乙醇的原料。此类海藻具有巨大市场需求和开发价值，目前产卡拉胶红藻养殖产业还相对落后，以野生种质通过营养繁殖的方式进行栽培。苗种长期营养繁殖已造成严重的种质退化，生长变慢、胶含量和强度减少和抗病能力变弱等，近年来已经对我国该产业发展造成很大损害。为此，有必要深入探讨此类海藻保苗和育种工作，以维持产卡拉胶红藻产业长期稳定发展。基于该藻有性生殖难以发现，而无性繁殖又严重退化，本文从海藻枝段培养和原生质体制备角度开展工作，目的为进一步探讨细胞融合与杂交等工作，最终开展长心卡帕藻和细齿麒麟菜人工保苗和育种新途径提供基础数据和技术方法；同时，针对目前该海藻在长途运输过程中易于失活问题，开展了相关鲜活材料保存技术研究，为这类海藻产业可持续发展提供基础支撑技术。主要工作进展如下：1)可利用纤维素酶和果胶酶组合酶液酶解长心卡帕藻和细齿麒麟菜，得到游离细胞和极少数原生质体。在30℃、pH6.0和0.4g藻泥+3ml酶液条件下酶解48h，可获得长心卡帕藻和细齿麒麟菜最大游离细胞产量，其产量分别为6.48106Cell和6.80106Cell；而最高游离细胞产率的酶解条件为：30℃、pH6.0和0.1g藻泥+3ml酶液条件下酶解48h，在此条件下，长心卡帕藻和细齿麒麟菜游离细胞产率分别为1.70107Cell·g-1和1.62107Cell·g-1。同时，在酶含量一定时，藻泥用量越多可获得的游离细胞产量越多，但其产率下降；在20-30℃酶解温度梯度内，游离细胞产量随温度升高而增加；酶解pH实验结果表明，pH6.0的弱酸性环境更有利于游离细胞产生，pH7.0和8.0时酶解效率有一定程度下降；12-24h的酶解时间梯度实验表明，游离细胞产量随酶解时间的延长而增加。2)实验表明，利用篮子鱼内脏制备消化酶液，可酶解制备长心卡帕藻和细齿麒麟菜原生质体，原生质体通过细胞培养的方法可以获得愈伤组织，通过PEG诱导融合的方法可以产生融合细胞。其中25℃、pH6.0和0.4g藻泥+3ml酶液，酶解48h条件下，细齿麒麟菜原生质体产量最大，为4.15103Cells，而上述条件也最有利于获得长心卡帕藻原生质体，其最大产量为3.8103Cells。为得到最高原生质体产率，可选择的酶解条件：25℃、pH6.0、0.1g藻泥+3ml酶液条件下酶解48h，在此酶解条件下，细齿麒麟菜原生质体得率高于长心卡帕藻，其中细齿麒麟菜原生质体最高产率达到1.75104Cells·g-1，而长心卡帕藻的最高原生质体产率为1.45104Cells·g-1；藻泥与酶浓度配比实验表明，长心卡帕藻或细齿麒麟菜藻泥越多所制备出的原生质体产量越多，但其制备效率却越低；酶解温度（20-30℃）梯度实验表明其最高原生质体产量和效率的酶解温度为25℃，在pH6.0-8.0的酶解梯度中，酶解pH6.0时酶解效果最好；在12-48h酶解时间梯度内，酶解时间越长，长心卡帕藻或细齿麒麟菜原生质体制备效率越高，即酶解48h时原生质体产量和得率最高。3)通过海藻枝段培养，可诱导长心卡帕藻和细齿麒麟菜藻段产生新愈伤组织小苗。在三种实验的海水培养基（F/2、PES和ESS）中，长心卡帕藻和细齿麒麟菜在PES培养基中的藻段存活率最高；在植物生长调节物质添加试验中，1mg/L萘乙酸和0.5mg/L玉米素处理组的藻段存活率，明显高于1mg/L生长素和0.5mg/L玉米素处理组，也高于未添加激素对照组；在50-200μmol m-2s-1光照强度梯度实验表明，光照100μmol m-2s-1条件下长心卡帕藻和细齿麒麟菜的存活率最高；对比水平、竖直和纵切水平放置方式的培养结果表明，横切水平放置的长心卡帕藻和细齿麒麟菜存活率最高。4)系列鲜活材料的离水保活实验表明，可保存长心卡帕藻和细齿麒麟菜活性的最长时间为5天，保存这类热带产胶海菜活性最高的最佳条件为温度17-20℃、相对湿度70-100%和避免光照的黑暗条件。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章研究背景  11-21
  1 长心卡帕藻和细齿麒麟菜的经济价值  12-13
  2 长心卡帕藻和细齿麒麟菜的养殖现状与问题  13-17
    2.1 栽培历史与地域  13-14
    2.2 基础生活史  14
    2.3 海藻的生活特性  14-15
    2.4 常见的栽培方式  15-16
    2.5 栽培现状与问题  16-17
    2.6 传统保苗育种方法的现状与问题  17
  3 原生质体制备在海藻保苗育种方面的应用  17-19
  4 现代生物学方法育种的问题与展望  19-20
  5 研究内容  20-21
第二章长心卡帕藻和细齿麒麟菜原生质体制备  21-41
  1 材料方法  21-26
    1.1 实验材料来源  21-22
    1.2 实验所用的溶液与培养基  22-23
    1.3 实验材料处理  23
    1.4 纤维素和果胶酶组合酶液配制  23-24
    1.5 篮子鱼内脏提取酶液配制  24
    1.6 酶解与纯化  24-25
    1.7 原生质体制备效果的鉴定  25
    1.8 原生质体产量与产率统计  25
    1.9 细胞融合诱导  25
    1.10 原生质体培养  25-26
  2 实验结果  26-38
    2.1 纤维素酶和果胶酶组合酶液酶效果  26-30
    2.2 篮子鱼内脏提取酶液酶解法制备效果  30-37
    2.3 原生质体培养结果  37
    2.4 原生质体融合  37-38
  3 讨论  38-41
    3.1 通过纤维素酶和果胶酶组合酶液制备热带产卡拉胶红藻游离细胞  38
    3.2 通过篮子内脏提取液制备热带产卡拉胶红藻原生质体  38-41
第三章长心卡帕藻和细齿麒麟菜枝段培养  41-48
  1 材料方法  41-43
    1.1 实验材料来源  41
    1.2 培养室条件  41
    1.3 培养液与培养基  41-42
    1.4 材料的预培养  42
    1.5 消毒培养  42
    1.6 海藻枝段培养方法与方案设计  42-43
    1.7 藻段存活率统计  43
  2 实验结果  43-47
    2.1 培养基的影响  43-44
    2.2 植物生长调节物质配比的影响  44-45
    2.3 光照的影响  45-46
    2.4 接种方式的影响  46
    2.5 藻段切面处长出新的小芽  46-47
  3 讨论  47-48
第四章长心卡帕藻和细齿麒麟菜离水保存方法  48-51
  1 材料方法  48-49
    1.1 实验材料  48
    1.2 海藻离水保存方法  48-49
  2 实验结果  49-50
  3 讨论  50-51
第五章结论  51-52
参引文献  52-60
附表  60-62
作者简历及硕士在读期间完成的论文和研究成果  62

两种产卡拉胶红藻原生质体制备与枝段培养

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