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嗜热类磷酸三酯酶的内酯酶分子进化以提高对有机磷杀虫剂的降解活力

作　者: 张宇
导　师: 冯雁
学　校: 吉林大学
专　业: 微生物学
关键词: 类磷酸三酯酶的内酯酶酶的非专一性有机磷化合物杀虫剂定向进化晶体结构
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

自二十世纪五十年代以来，有机磷化合物已被广泛地用于农用杀虫剂。由于有机磷化合物能不可逆抑制动物神经系统中的乙酰胆碱酯酶，破坏神经传递，因此对人及家畜等脊椎动物具有极强的毒副作用。由于杀虫剂的过量和连续使用，许多地区土地、水生态系统被有机磷化合物污染，对人类健康构成巨大威胁。目前去除有机磷污染物的方法(漂白处理、碱水解、焚烧或填埋处理等)反应条件剧烈、副产物具有毒性及腐蚀性，限制了广泛应用。微生物来源的磷酸三酯酶(PTE, EC3.1.8.1)可以广泛水解有机磷杀虫剂，具有环保和原位解毒优势，提供了生物修复新途径。由于磷酸三酯酶均来源于常温微生物，较低的生物学稳定性限制了其实际应用。因此，应用生物技术手段，研发生物学稳定性好、广谱、高效的有机磷杀虫剂降解酶势在必行。通过检索细菌基因组数据库，我们发现嗜热细菌Geobacillus kaustophilus HTA426基因组DNA中含有一个磷酸三酯酶(命名为GkaP)编码序列GK1506(GenBank ID:3183579)，我们对该基因进行了异源表达，并对重组蛋白的酶学性质、催化机制及分子进化等方面开展了系统研究。重组GkaP具有优异的生物稳定性，它能够有效的水解各种内酯，以及“非专一性”的磷酸三酯酶活力及酯酶活力。因此GkaP应该被归类到近年来新命名的类磷酸三酯酶的内酯酶(posphotriesterase-like lactonase, PLL)家族。酶的催化“非专一性”是趋异进化成新功能的一个显著特征，研究酶的“非专一性”有助于我们理解蛋白的进化及其祖先，因此GkaP成为了研究磷酸三酯酶趋异进化的理想模式酶。为了探索GkaP独特的“非专一性”催化机制，我们对其金属中心附近热点(hot-spot)氨基酸的功能进行了研究，发现Tyr99位点可能与磷酸三酯酶的趋异进化密切相关。其中一个突变体Y99L对乙基对氧磷的催化效率(kcat/Km)提高11倍，但对δ-癸内酯的催化效率降低15倍，使得底物选择性产生了157倍的转化。对Y99L晶体结构分析表明，突变导致了相邻的loop7发生了大约6.6的向外偏移，这种精细的构象变化可能增加了活性中心的柔性，有利于对磷酸三酯底物识别和催化。我们还选择了假定的质子穿梭路径相关的残基(R230和G209)进行了研究。动力学数据表明突变体G209D的磷酸三酯酶和内酯酶活性分别提高了10倍和3倍，该突变体的晶体结构显示一个水分子与R230和D209分别形成了氢键，这导致R230的侧链构象发生偏转最终使得loop7区域背离活性中心发生大约2的移动。我们推测底物结合loop (loop7)的向外偏移可能创造了更大的底物结合空间，使得更有利于酶对不同底物的催化。我们的工作表明通过少数氨基酸取代可能影响底物结合loop区的动态和构象分布，从而改变“非专一性”酶对底物识别和催化的能力。这些结果对于理解“非专一性”酶的催化机制提供了新的线索。蛋白质工程技术是提高酶的催化效率、改变底物选择性的有效方法。我们以GkaP为模板进化其潜在的有机磷水解能力。结合理性设计和随机突变的策略，经过四轮的突变和筛选(大约10,000个克隆)，获得了若干磷酸三酯酶活力显著提高的突变体。其中最优的突变体26A8C对于有机磷杀虫剂乙基对氧磷(ethyl-paraoxon)的催化效率相比野生型提高了232倍。除此，该突变体对于其它有机磷杀虫剂例如对硫磷(parathion)、地亚农(diazinon)和氯螨硫磷(chlorpyrifos)的活力提高了19-497倍，极大地拓宽了对有机磷杀虫剂的选择性。同时该突变体的内酯酶活力具有766倍的减少，使得GkaP由一个“非专一性”内酯酶转变成了“专一性”的有机磷水解酶。突变体26A8C含有8个氨基酸的取代：F28I、Y99L、T171S、F228L、N269S、V270G、W271C、G273D。通过结构分析发现大部分突变位点(F228L、N269S、V270G、W271C和G273D)均位于底物结合loop7和8上，进一步证明这两段表面loop在磷酸三酯酶乃至整个酰胺水解酶超家族对底物选择性具有重要作用。我们的工作不但有利于揭示磷酸三酯酶的趋异进化机制而且表明GkaP具有极大的进化潜力，它可以通过实验室进化手段创造高效的催化剂从而为有机磷毒物的降解提供潜在的解决方案。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章前言  13-45
  1.1 有机磷化合物及其神经毒性  13-15
  1.2 细菌磷酸三酯酶  15-20
    1.2.1 底物特异性和立体选择性  16
    1.2.2 X-ray 结构  16-17
    1.2.3 催化机理  17-18
    1.2.4 磷酸三酯酶的潜在应用  18-20
  1.3 磷酸三酯酶的趋异进化  20-22
  1.4 蛋白质工程简介  22-30
    1.4.1 蛋白质的理性设计  23-26
      1.4.1.1 底物特异性与立体选择性的改造  24
      1.4.1.2 活力改造  24-25
      1.4.1.3 稳定性改造  25
      1.4.1.4 酶分子结构元件嫁接  25-26
    1.4.2 蛋白质的非理性设计  26-28
      1.4.2.1 易错 PCR (error-prone PCR)  27
      1.4.2.2 同源基因重组 (homology-dependent gene recombination)  27-28
    1.4.3 蛋白质的半理性设计  28-30
      1.4.3.1 特定区域的随机突变  28-29
      1.4.3.2 随机突变后的定点饱和突变  29
      1.4.3.3 计算机辅助的半理性设计  29-30
  1.5 分子进化类磷酸三酯的酶内酯酶  30
  1.6 其它有机磷水解酶类  30-34
    1.6.1 二异丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases)  30-31
    1.6.2 血清对氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON)  31-32
    1.6.3 有机磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA)  32-33
    1.6.4 甲基对硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH)  33-34
  1.7 立题依据和实验设计  34-35
  1.8 参考文献  35-45
第二章嗜热磷酸三酯酶基因的克隆、表达及工程菌构建  45-59
  2.1 引言  45
  2.2 实验材料  45-47
    2.2.1 菌株和质粒  45
    2.2.2 主要试剂  45-46
    2.2.3 主要仪器  46
    2.2.4 培养基  46
    2.2.5 使用的数据库及软件  46-47
  2.3 实验方法  47-53
    2.3.1 Geobacillus kaustophilus HTA426 的复苏及培养  47-48
    2.3.2 G. kaustophilus HTA426 基因组 DNA 的提取  48
    2.3.3 来源于嗜热细菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆  48-51
      2.3.3.1 引物设计  48-49
      2.3.3.2 GK1506 基因的 PCR 扩增  49
      2.3.3.3 GK1506 的酶切和纯化  49-50
      2.3.3.4 pET-28a 载体制备  50
      2.3.3.5 连接产物的转化  50
      2.3.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  50-51
      2.3.3.7 连接产物的转化  51
      2.3.3.8 阳性克隆的筛选及鉴定  51
    2.3.4 GK1506 基因的预表达  51-52
    2.3.5 GkaP 的分离纯化  52
    2.3.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  52-53
  2.4 结果与讨论  53-57
    2.4.1 同源序列比对及进化关系分析  53-54
    2.4.2 磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 扩增  54-55
    2.4.3 重组质粒的构建、转化及阳性克隆的鉴定  55-56
    2.4.4 目的蛋白的表达和纯化  56-57
  2.5 小结  57
  2.6 参考文献  57-59
第三章 GkaP 的酶学性质  59-73
  3.1 引言  59
  3.2 材料与方法  59-63
    3.2.1 实验材料  59
    3.2.2 酶活力测定方法  59-60
      3.2.2.1 磷酸三酯酶活力测定方法  59-60
      3.2.2.2 内酯酶活力测定方法  60
      3.2.2.3 羧酸酯酶活力测定方法  60
    3.2.3 最适温度和热稳定性测定  60-61
    3.2.4 最适 pH 和 pH 稳定性测定  61
    3.2.5 动力学常数的测定  61
    3.2.6 不同的二价金属离子取代对酶活性的影响  61-62
    3.2.7 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响  62
    3.2.8 蛋白的金属含量测定  62-63
  3.3 结果与讨论  63-69
    3.3.1 GkaP 的最适温度和热稳定性  63-64
    3.3.2 GkaP 的最适 pH 和 pH 稳定性  64
    3.3.3 GkaP 的催化“非专一性”  64-67
    3.3.4 不同的二价离子构建的 GkaP 对酶活力的影响  67
    3.3.5 GkaP 的金属含量分析  67-68
    3.3.6 金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响  68-69
  3.4 小结  69-70
  3.5 参考文献  70-73
第四章 GkaP 活性中心附近热点氨基酸的突变体设计与功能研究  73-91
  4.1 引言  73-76
  4.2 实验方法  76-79
    4.2.1 同源序列比对  76
    4.2.2 定点突变和定点饱和突变  76-77
    4.2.3 饱和突变库的筛选  77-78
    4.2.4 野生型 GkaP 及其突变体的表达、纯化  78
    4.2.5 动力学常数测定  78
    4.2.6 野生型 GkaP 及其突变体对各种杀虫剂的比活力测定  78-79
    4.2.7 底物的分子对接  79
  4.3 结果与讨论  79-87
    4.3.1 GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位点饱和突变库的构建和筛选  79-80
    4.3.2 突变体的动力学常数分析  80-82
    4.3.3 突变体对于几种有机磷杀虫剂的比活力  82-84
    4.3.4 GkaP 突变体活力变化的结构基础  84-87
  4.4 小结  87-88
  4.5 参考文献  88-91
第五章 GkaP 的分子进化—提高对有机磷杀虫剂的降解活力  91-107
  5.1 引言  91
  5.2 实验方法  91-95
    5.2.1 定点突变和定点饱和突变  91-92
    5.2.2 全基因易错 PCR 突变库的构建  92-93
    5.2.3 突变库筛选  93
    5.2.4 突变体的表达和纯化  93-94
    5.2.5 动力学常数和各种杀虫剂比活力测定方法  94
    5.2.6 突变体的热稳定性、最适温度和 pH 测定  94
    5.2.7 突变体的同源建模  94-95
  5.3 结果与讨论  95-105
    5.3.1 GkaP 的进化策略  95-96
    5.3.2 突变体的动力学常数分析  96-100
    5.3.3 突变体的热稳定性分析  100-101
    5.3.4 突变体的生化性质表征 (最适温度和最适 pH)  101
    5.3.5 突变体对不同有机磷杀虫剂的比活力  101-104
    5.3.6 突变位点的结构分析  104-105
  5.4 小结  105-106
  5.5 参考文献  106-107
创新点  107-109
展望  109-111
作者简历  111
攻读博士期间发表成果  111-113
参与的科研课题  113-115
致谢  115

嗜热类磷酸三酯酶的内酯酶分子进化以提高对有机磷杀虫剂的降解活力

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