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玫烟色棒束孢几丁质酶Ⅱ基因的克隆、表达及两种几丁质酶的诱导转录

作　者: 孟祥云
导　师: 黄勃; 李增智
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 虫生真菌玫烟色棒束孢几丁质酶酵母表达实时荧光定量
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

虫生真菌作为农林生态系中昆虫的重要致死因子，具有显著的流行潜力，对维持生态平衡具有重要作用。有些虫生真菌已被开发为真菌杀虫剂，进而广泛地应用于防治农林害虫。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea作为一类较为常见的虫生真菌，世界性分布，可寄生鳞翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目等多类昆虫。玫烟色棒束孢在北美和欧洲已被用于温室害虫的生物防治，目前已有真菌杀虫剂产品登记注册用于温室粉虱、蚜虫、蓟马和介壳虫的防治。前人研究表明，虫生真菌中常常存在多个几丁质酶，但各自在侵染中的作用主次尚未阐明。本课题组在先前的研究中，克隆获得了一个玫烟色棒束孢的几丁质酶Ifuchit1。在本研究中，我们运用RT-PCR和DNA步移技术从玫烟色棒束孢中又分离得到了一种新的几丁质酶基因Ifuchit2，序列已递交国际权威基因数据库GenBank登录，序列号为HQ267382。该基因全长1584bp，5′端非翻译区111bp，3′端非翻译区有202bp,开放阅读框(ORF)1272bp,编码423个氨基酸。信号肽长度为22个氨基酸。其编码蛋白理论分子量为46.57kDa，理论等电点为5.169。423个氨基酸中含强碱氨基酸37个（K，R），强酸氨基酸48个（D，E），疏水氨基酸150个（A，I，L，F，W，V），极性氨基酸119个（N，C，Q，S，T，Y）。通过Blast对保守区进行预测,发现该几丁质酶基因含有几丁质的活性位点（DGIDIDWE）和结合区域（SIGG），属于糖基水解酶18家族。又运用特异性PCR扩增和DNA步移技术，分别从玫烟色棒束孢中克隆得到几丁质酶的基因组序列和上游序列。结构基因总长1425bp，扩出的结构基因DNA与其cDNA比较含有三个内含子，分别位于距离起始密码子的121碱基至176碱基处，277碱基至331碱基处和380碱基至431碱基处，大小分别为54bp，53bp，51bp。在玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2结构基因的基础上，克隆得到了其上游序列。该基因上游序列大小为1794bp（序列号：JF323024），其中有209bp与该基因cDNA序列相互重叠。序列分析表明，玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2上游序列中，含有真核生物基因典型的TATA-盒，以及多个高度保守的潜在转录因子结合位点,如Oct1、 GATA-1、 GATA-2、CdxA等。另外，该上游序列还存在一些特异的应答元件，如热激应答元件（HSE）、胁迫应答元件（STRE）等。将克隆获得的玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2基因连接到分泌性表达载体pPIC9K上后，通过电转化，转入毕赤酵母GS115。经甲醇诱导144h，离心收集上清，测定酶活37.3U/ml。将表达后的几丁质酶粗酶液，通过80%硫酸铵蛋白沉淀，离心收集沉淀，并用50mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解后，在相同的缓冲液中透析24h，离心弃沉淀。酶液经DEAE-Sepharose柱进行蛋白纯化。将具有活性的收集液采用PEG20000进行浓缩。最后以SDS-PAGE凝胶检测该蛋白，得到分子量为46kDa左右，与预测的结果（46.57kDa）及相关报道结果相接近。玫烟色棒束孢RCEF3304菌株在粉状几丁质为诱导物的条件下，经12h，36h，60h诱导后，提取总RNA。同时根据几丁质酶Ifuchit2基因和几丁质酶Ifuchit1基因序列设计引物，利用Realtime-PCR荧光检测技术比较两种几丁质酶基因在诱导前后自身转录水平以及两者之间表达量变化的差异，结果表明两种几丁质酶基因经诱导后，转录量均有所提高，且几丁质酶Ifuchit1的基因无论在诱导前还是诱导后，转录表达量都明显高于Ifuchit2，两者的表达量相差大约十几倍。因此，我们推测这两种几丁质酶属于诱导性酶，且Ifuchit1可能是玫烟色棒束孢几丁质酶类的主效基因，在菌株侵染过程中起主要作用。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
附图清单  11-13
附表清单  13-14
主要缩略词和符号表  14-15
第一章文献综述  15-25
  1 研究背景  15-16
    1.1 昆虫病原真菌防治害虫发展历史  15
    1.2 虫生真菌的致病机制  15-16
  2 几丁质  16-17
  3 几丁质酶  17-20
    3.1 几丁质酶的分类  17-19
      3.1.1 依据来源的分类  17-19
      3.1.2 依据水解几丁质酶特性的分类  19
      3.1.3 依据氨基酸顺序同源性的分类  19
    3.2 几丁质酶基因表达调控  19-20
  4 真核表达研究  20-22
    4.1 表达载体和受体菌  20-21
    4.2 毕赤酵母高效表达的关键问题  21-22
    4.3 应用前景  22
  5 实时荧光定量 PCR 技术  22-25
第二章引言  25-26
第三章玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2 的 cDNA 和上游序列克隆与分析  26-45
  1 引言  26
  2 材料与方法  26-37
    2.1 材料  26-28
      2.1.1 实验菌株  26
      2.1.2 主要化学试剂  26
      2.1.3 主要培养基  26-27
      2.1.4 常用的缓冲液和贮藏液  27
      2.1.5 主要的仪器设备  27-28
    2.2 方法  28-37
      2.2.1 玫烟色棒束孢菌丝的制备  28
      2.2.2 玫烟色棒束孢菌丝 RNA 与 DNA 的提取  28-29
      2.2.3 cDNA 第一链的合成  29-30
      2.2.4 cDNA 的特异片段的 RT-PCR 扩增  30-31
      2.2.5 琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物  31
      2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  31-32
      2.2.7 克隆转化  32
      2.2.8 阳性克隆的菌落 PCR 验证  32-33
      2.2.9 序列测定与分析  33
      2.2.10 RACE 模板的合成  33-34
      2.2.11 cDNA3′端的 RACE-PCR 扩增及 5′Genome Walking 扩增  34-37
      2.2.12 玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2cDNA 全长及结构基因克隆  37
      2.2.13 DNA 步移法扩增 Ifuchit2 基因 5′-上游区序列  37
      2.2.14 序列分析  37
  3 结果与分析  37-43
    3.1 RNA 的提取  37-38
    3.2 RT-PCR 得到基因特异性片段  38
    3.3 玫烟色棒束孢几丁质酶 Ifuchit2 基因全长 cDNA 的克隆  38-39
    3.4 玫烟色棒束孢 Ifuchit2 基因 cDNA 序列分析  39-41
    3.5 Ifuchit2 结构基因的获得  41
    3.6 Ifuchit2 基因上游序列的克隆与分析  41-43
  4 讨论  43-45
第四章玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2 在毕赤酵母中表达及重组蛋白纯化  45-58
  1 引言  45
  2 材料与方法  45-56
    2.1 材料  45-48
      2.1.1 菌株  45
      2.1.2 主要试剂  45
      2.1.3 酶活测定各种试剂制备  45-46
      2.1.4 毕赤酵母表达各种试剂的配制  46
      2.1.5 主要培养基配方  46-47
      2.1.6 SDS-PAGE 电泳使用溶液的配制  47
      2.1.7 主要仪器设备  47-48
    2.2 方法  48-53
      2.2.1 Ifuchit2 基因的表达载体的构建  48-49
      2.2.2 酵母表达质粒 pPIC9K 制备  49
      2.2.3 酶切后的酵母表达质粒 pPIC9K 与目的基因片段 DNA 的连接  49-50
      2.2.4 表达载体的酶切鉴定  50
      2.2.5 毕赤酵母电转化  50-52
        2.2.5.1 酵母菌感受态细胞制备  50
        2.2.5.2 电击转化  50-51
        2.2.5.3 PCR 鉴定酵母表达重组子  51-52
      2.2.6 毕赤酵母多拷贝克隆的筛选  52
      2.2.7 重组毕赤酵母工程菌株外源基因的诱导表达  52
      2.2.8 几丁质酶酶活测定  52
      2.2.9 重组蛋白的纯化及 SDS-PAGE 分析  52-53
    2.3 结果与分析  53-56
      2.3.1 Ifuchit2 基因的表达载体的构建  53
      2.3.2 酵母表达载体 pPIC9K-Ifuchit2 的酶切鉴定  53-54
      2.3.3 毕赤酵母多拷贝克隆的筛选  54-55
      2.3.4 重组蛋白诱导表达、纯化及 SDS-PAGE 分析  55-56
  3 讨论  56-58
第五章 Realtime-PCR 法研究玫烟色棒束孢中两种几丁质酶基因的诱导转录  58-69
  1 引言  58
  2 材料和方法  58-61
    2.1 菌株来源、试剂  58
    2.2 培养基  58-59
    2.3 主要仪器  59
    2.4 实验方法  59-61
      2.4.1 玫烟色棒束孢菌丝培养  59
      2.4.2 提取玫烟色棒束孢菌丝 RNA 和 DNA  59
      2.4.3 引物的设计与合成  59-60
      2.4.4 标准曲线的制备  60
      2.4.5 玫烟色棒束孢两种几丁质酶表达量的绝对定量检测  60-61
      2.4.6 数据分析  61
  3 结果与分析  61-68
    3.1 玫烟色棒束孢诱导前后 RNA 的提取  61-62
    3.2 Realtime-PCR 标准曲线的获得与分析  62-66
    3.3 几丁质酶基因 Ifuchit1 和 Ifuchit2 表达量变化  66-68
  4 讨论  68-69
第六章结论  69-70
参考文献  70-77
致谢  77-78
作者简介  78
攻读硕士学位期间发表的学术论文  78
参与的科研项目  78

玫烟色棒束孢几丁质酶Ⅱ基因的克隆、表达及两种几丁质酶的诱导转录

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