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沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

作　者: 李燕燕
导　师: 虞鹏程
学　校: 南昌大学
专　业: 动物学
关键词: 沼泽绿牛蛙抗菌肽分离纯化生物活性
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本研究以沼泽绿牛蛙为实验材料,第一步对沼泽绿牛蛙的4种不同诱导方式所产生的4种产物进行了抗菌活性实验,结果表明4种诱导产物对金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌有一定的抑菌活性,但对酵母菌抑菌活性不明显。其抑菌活性由强到弱依次是电击后蛙皮分泌液＞注射去甲肾上腺素后蛙皮分泌液＞灭活菌诱导后的血清＞蛙皮浸提液,最小抑菌数量级的范围为32～128μg/mL。实验第二步以抑菌活性最强的电击后蛙皮分泌液为样品,经Sephadex G-50凝胶过滤初步分离后,采用C₁₈制备型反相高效液相色谱柱分离,使用线性梯度洗脱方法,对照RP-HPLC图谱,按每峰一管收集洗脱液,冷冻干燥。接着用纸片法测定每管冻干粉的抑菌活性,并用分析型反相高效液相色谱经C₁₈柱对抑菌活性最强的冻干粉进行纯度测定,Tricine-SDS-PAGE检测其分子量。结果表明;分离纯化后的冻干粉中蛋白类分子含量比较纯,其分子量约为3800Da。命名为抗菌肽GUEⅠ。实验第三步,使用蛋白质测序仪对抗菌肽GUEⅠ测序,结果表明;抗菌肽GUEⅠ由34个氨基酸残基构成,序列为FWFLDILNKTLGKIVNLFAGHLIKCTKVLTCPLP,理论分子量为3858.789Da。将测出的序列输入抗菌肽数据库（http;//aps.unmc.edu/AP/main.php）进行序列比对分析,发现与抗菌肽RANATUERIN 3的序列相似性是57.89%,与抗菌肽RANATUERIN 2的序列相似性是45.94%,并对抗菌肽GUEⅠ使用ANTHEPROT 5.0软件进行了二维空间结构预测。采用二倍稀释法测定对7种常见菌的抑制作用,发现抗菌肽GUEⅠ对4种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌的MIC处于8～16μg/mL之间,但对酵母菌的抑制作用不强。通过以上分析,推断抗菌肽GUEⅠ是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中分离纯化的抗菌肽,本研究为蛙类抗菌肽的理论研究和生产奠定了一定基础。

沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

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