学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻广谱抗性相关基因OsMOS3的克隆及功能研究

作　者: 吴青青
导　师: 江海洋
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: OsMOS3 水杨酸系统获得抗性水稻
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 12次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

水稻是我国主要的粮食作物，在其生产过程中由于受到稻瘟病、纹枯病以及白叶枯病的危害，水稻的质量与产量受到严重的影响。本研究主要利用水稻基因组信息并结合生物信息学，对水稻广谱抗病性基因OsMOS3进行克隆并实现克隆基因的过量表达、RNAi以及融合表达，通过转基因水稻对白叶枯病病原菌抗性的研究以及水杨酸含量的分析，表明OsMOS3具有广谱抗病性。具体结果如下：1. OsMOS3及干涉片段mir的克隆结合生物信息学，在水稻基因组中获得与拟南芥中已经克隆的AtMOS3的同源序列，将其命名为OsMOS3。以水稻日本晴的cDNA为模板，设计特异性引物分别扩出OsMOS3A段，1475bp，OsMOS3B段，1543bp，最后通过重叠PCR (overlap)扩出OsMOS3的cDNA全长（A+B段），3018bp。另外，根据结构域分析，在OsMOS3中选取一段保守且含有功能结构域的核苷酸序列作为干涉片段mir，经特异性PCR扩增获得mir，250bp。分别构建出双元表达载体CPB-OsMOS3， CPB-2F，P1302-OsMOS3-GFP。2.35S-OsMOS3-GFP的亚细胞定位通过基因枪将35S-OsMOS3-GFP融合表达质粒瞬时转化到洋葱表皮细胞，利用荧光显微镜进行亚细胞定位检测，结果显示OsMOS3定位在细胞核内。3. T0代转基因水稻的阳性检测分别对获得的3株OsMOS3过表达转基因植株，1株OsMOS3-RNAi转基因植株，进行筛选标记基因潮霉素（HPT）的PCR检测，结果表明获得的4株水稻全为阳性转基因水稻；OsMOS3半定量凝胶结果显示：与原始对照植株相比，OsMOS3过表达水稻中OsMOS3上调表达，O sMOS3-RANi转基因水稻中OsMOS3表达沉默。4. T0代转基因水稻的抗病性鉴定分别检测了OsMOS3过表达、OsMOS3-RNAi、及原始对照日本晴植株体内游离态水杨酸（free SA）的含量，结果显示：OsMOS3过表达转基因水稻free SA的含量明显高于对照及RNAi转基因水稻；在幼叶期及剑叶期分别对OsMOS3过表达、 OsMOS3-RNAi、及原始对照日本晴植株进行白叶枯病病原菌接种鉴定，结果表明： OsMOS3过表达转基因水稻的抗病能力明显提高，而OsMOS3-RNAi水稻更易感病。综上所述，OsMOS3是通过SA在植株体内的积累，参与SAR信号通路，从而提高植株的整体抗病水平。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-9
1.文献综述  9-16
  1.1 概述  9
  1.2 植物的免疫系统  9-10
    1.2.1 植物的初级免疫反应  9
    1.2.2 植物的次级免疫反应  9-10
  1.3 R 基因的研究  10-12
    1.3.1 R基因的结构  10-11
    1.3.2 R基因作用机制  11-12
  1.4 植物病程相关蛋白  12
  1.5 植物抗病反应中的信号分子  12-13
    1.5.1 水杨酸介导的抗病信号途径  13
    1.5.2 乙烯介导的抗病信号途径  13
    1.5.3 茉莉酸介导的抗病信号途径  13
  1.6 广谱抗病基因研究现状  13-15
  1.7 生物信息学在功能基因研究中的作用  15-16
2. 引言  16-18
  2.1 研究的内容  16
  2.2 研究的意义  16-17
  2.3 实验技术路线  17-18
3．材料和方法  18-37
  3.1 实验材料  18
    3.1.1 植物材料  18
    3.1.2 载体材料  18
    3.1.3 实验试剂及器材  18
  3.2 培养基  18-19
    3.2.1 大肠杆菌培养基  18
    3.2.2 农杆菌培养基  18
    3.2.3 水稻组织培养基  18-19
    3.2.4 白叶枯病培养基  19
  3.3 OsMOS3扩增  19-25
    3.3.1 PCR引物设计  19-20
    3.3.2 Trizol法提取RNA  20-21
    3.3.3 反转录  21
    3.3.4 重叠PCR扩增OsMOS3基因  21-23
    3.3.5 干涉片段mir的扩增  23
    3.3.6 PCR产物的回收纯化  23-24
    3.3.7 连入pEASY-T1克隆载体  24
    3.3.8 质粒的提取  24-25
  3.4 OsMOS3生物信息学分析  25
    3.4.1 OsMOS3蛋白组成分析  25
    3.4.2 OsMOS3蛋白结构域分析  25
    3.4.3 OsMOS3蛋白与其同源序列进化树分析  25
  3.5 OsMOS3表达载体的构建  25-32
    3.5.1 过表达载体的构建  25-26
    3.5.2 CBP-2F干涉载体的构建  26-29
    3.5.3 GFP融合表达载体的构建  29-32
  3.6 OsMOS3的亚细胞定位  32-33
  3.7 根癌农杆菌EHA105的转化  33
    3.7.1 感受态的制取  33
    3.7.2 转化  33
    3.7.3 阳性克隆的鉴定  33
  3.8 水稻遗传转化  33-34
    3.8.1 诱导  33-34
    3.8.2 侵染  34
    3.8.3 选择  34
    3.8.4 分化  34
    3.8.5 生根  34
    3.8.6 炼苗及大田移栽  34
  3.9 转基因水稻的阳性检测  34-36
    3.9.1 CTAB法提取基因组  34-35
    3.9.2 筛选标记潮霉素的PCR检测  35
    3.9.3 转基因植株OsMOS3半定量分析  35-36
  3.10 转基因水稻的抗病性检测  36-37
    3.10.1 白叶枯病活体接种鉴定  36
    3.10.2 FreeSA含量的测定  36-37
4.结果与分析  37-46
  4.1 目的基因的克隆  37-39
    4.1.1 日本晴总RNA的提取  37
    4.1.2 OsMOS3基因全长的扩增  37-38
    4.1.3 干涉片段mir的扩增  38-39
  4.2 OsMOS3生物信息学分析  39-40
  4.3 OsMOS3表达载体的构建  40-42
    4.3.1 OsMOS3过表达载体的构建  40
    4.3.2 OsMOS3干涉载体的构建  40-41
    4.3.3 OsMOS3融合表达载体的构建  41-42
  4.4 OsMOS3的亚细胞定位  42
  4.5 水稻遗传转化  42-43
  4.6 筛选标记的PCR检测  43
  4.7 OsMOS3半定量分析  43-44
  4.8 转基因水稻抗病性检测  44-46
    4.8.1 白叶枯病抗性鉴定  44-45
    4.8.2 FreeSA的HPLC测定  45-46
5. 讨论  46-48
  5.1 OsMOS3的进化  46
  5.2 OsMOS3的抗病途径  46
  5.3 OsMOS3在水稻抗病育种上应用及意义  46-48
6. 结论  48-49
参考文献  49-55
附录A：中英文缩写与注释  55-56
附录B：OsMOS3测序结果拼接图  56-57
附录C：OsMOS3蛋白比对图  57-58
致谢  58-59
个人简介  59-60
在读期间发表的学术论文  60

水稻广谱抗性相关基因OsMOS3的克隆及功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文