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黄瓜生长素受体同源基因的克隆及其遗传转化

作　者: 鲍林文
导　师: 王利琳; 陈哲皓
学　校: 杭州师范大学
专　业: 植物学
关键词: 黄瓜 生长素受体 基因克隆 RNA干涉 瞬时转化
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 54次
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内容摘要


黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种重要的园艺和经济作物,更是植物分子生物学研究的好材料,它不需要特别的光周期诱导就能自主开花,营养生长期也很短。黄瓜的全基因组序列测定已由我国科学家于2009年完成(Huang et al.,2009),但目前尚未有关于黄瓜中生长素受体的克隆、表达模式分析及其调控机制和生物学功能的研究报道,基于此本论文开展了相关的实验,所取得主要研究成果如下：1、克隆了黄瓜中生长素受体的同源基因CsTIR和CsAFB,构建了过量表达载体35S:CsTIR和35S:CsAFB;同时构建了相应的RNA干涉载体CsTIR-RNAi和CsAFB-RNAi。2、通过烟草叶片瞬时转化实验,证明构建的RNA干涉载体可以抑制目的基因的表达,起到干涉的效果。3、建立了高效的黄瓜离体再生体系：以6天苗龄的黄瓜子叶节作为外植体,MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L AgNO3再生培养25天后可以得到大量不定芽。4、确定了黄瓜转基因抗性芽潮霉素筛选的浓度为10mg/L。5、通过半定量RT-PCR鉴定了黄瓜不同组织中内源CsTIR和CsAFB基因的表达量。10天幼苗中,CsAFB和CsAFB基因的表达量都在根和叶中较高,茎中相对较少；幼苗的茎中几乎检测不到CsTJR的表达；70天成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB的表达,其中CsAFB基因在不同组织中的表达量比较一致,而CsTIR.基因在营养器官茎、叶和卷须中的表达量略高于在花芽和花中的表达量。6、将35S:CsTIR(?)和35S:CsAFB遗传转化模式植物拟南芥,已得到35S:CsTIR T2代纯合体,和35S:CsAFBT1代转基因抗性苗。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-8
文中主要英文缩写  8-11
1 文献综述  11-19
  1.1 生长素在植物发育中的作用  11-13
    1.1.1 植物生长素作用机制  11-12
    1.1.2 生长素受体家族  12-13
  1.2 黄瓜遗传转化体系的研究现状  13-15
    1.2.1 黄瓜离体再生体系研究进展  13-14
    1.2.2 黄瓜遗传转化体系研究进展  14-15
  1.3 RNA干涉机制  15-17
    1.3.1 RNA干涉机制的发现及其原理  15-16
    1.3.2 RNA干涉在植物上的应用  16-17
  1.4 本论文的内容和研究意义  17-19
2 黄瓜中生长素受体同源基因的克隆及表达载体的构建  19-49
  2.1 材料与试剂  21
    2.1.1 材料  21
    2.1.2 试剂  21
    2.1.3 主要仪器  21
  2.2 实验方法  21-38
    2.2.1 CsTIR和CsAFB的克隆  21-29
    2.2.2 表达载体35S:CsTIR和35S:CsAFB的构建  29-31
    2.2.3 I-CsTIR和I-CsAFB片段的克隆  31-34
    2.2.4 干涉载体CsTIR-RNAi和CsAFB-RNAi的构建  34-37
    2.2.5 表达载体转化农杆菌GV3101  37-38
  2.3 结果与分析  38-47
    2.3.1 CsTIR和CsAFB的克隆  38-40
    2.3.2 表达载体35S:CsTIR和35S:CsAFB的构建  40-42
    2.3.3 I-CsTIR和I-CsAFB片段的克隆  42-44
    2.3.4 CsTIR-RNAi和CsAFB-RNAi的构建  44-47
  2.4 讨论  47-49
3 烟草叶片的瞬时转化  49-53
  3.1 材料与试剂  49-50
    3.1.1 材料  49
    3.1.2 试剂  49
    3.1.3 主要仪器  49-50
  3.2 实验方法  50-51
    3.2.1 农杆菌侵染液注射烟草叶片  50
    3.2.2 农杆菌侵染液的制备  50
    3.2.3 烟草叶片的注射  50
    3.2.4 烟草叶片提取RNA  50
    3.2.5 RNA逆转录成cDNA  50-51
    3.2.6 RT-PCR扩增  51
  3.3 实验结果  51-52
    3.3.1 RT-PCR检测CsTIR基因在烟草叶片中的表达  51
    3.3.2 RT-PCR检测CsAFB基因在烟草叶片中的表达  51-52
  3.4 讨论  52-53
4 农杆菌介导的35S:CsTIR、35S:CsAFB、CsTIR-RNAi以及CsAFB-RNAi对黄瓜的遗传转化  53-60
  4.1 材料与试剂  53
    4.1.1 材料  53
    4.1.2 试剂  53
    4.1.3 主要仪器  53
  4.2 实验方法  53-56
    4.2.1 黄瓜的培养  53-54
    4.2.2 黄瓜RNA提取  54
    4.2.3 RNA反转录合成cDNA  54
    4.2.4 半定量RT-PCR  54-55
    4.2.5 农杆菌侵染黄瓜  55-56
    4.2.6 洗菌  56
  4.3 实验结果  56-59
    4.3.1 黄瓜再生体系的建立  56-57
    4.3.2 黄瓜hyg筛选浓度的确定  57-58
    4.3.3 CsTIR和CsAFB基因在野生型黄瓜中的表达模式  58-59
    4.3.4 转基因黄瓜的RT-PCR验证  59
  4.4 讨论  59-60
5 农杆菌介导的35S:CsTIR和35S:CsAFB对拟南芥的遗传转化  60-63
  5.1 材料与试剂  60
    5.1.1 材料  60
    5.1.2 试剂  60
    5.1.3 主要仪器  60
  5.2 实验方法  60-61
    5.2.1 拟南芥的培养  60-61
    5.2.2 农杆菌侵染拟南芥  61
  5.3 实验结果  61-63
    5.3.1 转35S:CsTIR基因拟南芥的鉴定  61-62
    5.3.2 转35S:CsAFB基因拟南芥的鉴定  62-63
6 进一步工作安排  63-64
参考文献  64-69
附录一 常用培养基配方  69-70
附录二 常用抗生素和激素的配制  70

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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