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氧化应激下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和JNK的调控机制

作　者: 符跃强
导　师: 卢仲毅；许峰
学　校: 重庆医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞培养改良巴氏染色板层小体 ATⅡ细胞 H2O2 凋亡存活 JNK 氧化应激线粒体膜电位凋亡相关蛋白肺泡Ⅱ型上皮细胞丝裂原活化蛋白激酶活性氧 N-乙酰半胱氨酸
分类号: R563
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

第一部分原代大鼠肺泡II型上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定背景肺泡上皮易受各种应激的损伤,它的损伤后修复主要依赖于肺泡上皮的干细胞——肺泡II型上皮细胞(alveolar type II epithelial cells,ATII cells)。ATII细胞体积较小、呈立方形,占肺泡上皮细胞数的60%左右,能通过增殖、铺展、迁移,并最终转化为肺泡I型上皮细胞(alveolar type I epithelial cells, ATI cells),恢复肺泡上皮正常的形态和功能。另外,ATII细胞还具有很多重要功能:合成、分泌和重新利用表面活性物质;转运离子和水分;合成免疫效应分子。但ATII细胞的原代分离、纯化技术较为复杂,本研究的目的是掌握成年大鼠ATII细胞的分离、纯化和培养技术,以获得数量足够、纯度高的ATII细胞,满足下一步实验的需要。目的确定成年大鼠原代ATⅡ细胞分离1、纯化、培养的技术方法,为研究氧化应激下ATⅡ细胞存活、凋亡和信号转导机制提供数量足够和高纯度的ATⅡ细胞,以满足实验的需要。方法水合氯醛麻醉清洁级Spraque-Dawley大鼠(约200 g),打开胸腔行肺动脉插管,以生理盐水冲净肺血。整体取出心肺和气管,气管插管,以缓冲液灌洗肺泡腔10次。将0.08%胰蛋白酶消化液从气管注入肺泡,置于37°C,5%二氧化碳(carbon dioxide, CO2)培养箱,每隔5分钟添加适量消化液, 20分钟后,去除气管及肺门周围结缔组织置于250μg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)和终止血清混合液中,快速剪肺至1 mm3小块,筛网过滤,离心收集细胞, DMEM/F12培养基重悬细胞并转移至大鼠IgG包被的培养皿中,吸附纯化2 h,用含10%胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞,接种于6孔培养板或96孔培养板,细胞接种后24h换液,继续培养12h备用。台盼蓝拒染法测定细胞活力。透射电镜(Transmitting electron microscopy, TEM)鉴定细胞,改良巴式染色法确定细胞纯度。在体外培养细胞不同的时间(36、72、96和120 h)观察细胞的性状和形态变化。结果1.细胞的产量约为2×107个/只大鼠。2.电镜下观察到ATⅡ细胞典型细胞结构——板层小体;改良巴式染色法证实细胞纯度> 90%。3.台盼蓝拒染法测定细胞活力> 90%。4.体外培养36至72 h时细胞生长良好,细胞质内有较多颗粒;96 h以后细胞呈长索形,细胞内颗粒减少,并出现空泡。结论利用0.08%胰酶消化分离和大鼠Ig免疫粘附纯化,可获得高产量、高纯度、高活力的原代ATⅡ细胞,能满足实验的需要。ATⅡ细胞体外培养36至72 h时生长良好,可进行体外实验。第二部分氧化应激诱导肺泡II型上皮细胞的损伤作用及JNK调控作用背景氧气疗法是临床上治疗急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但长时间高氧暴露可引起氧化应激性肺损伤。高浓度氧气(氧气体积分数> 0.95,简称高氧)暴露下产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是导致氧化应激性肺损伤的主要致病因素。ROS可造成细胞膜脂质的过氧化损伤,蛋白质的应激性修饰,基因的畸变等细胞损伤,导致细胞完整性和功能的破坏。更为重要的是ROS还可通过激活细胞内凋亡信号系统而参与细胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在内的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases, MAPKs)家族信号通路是多种刺激通过细胞膜到达细胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和p38三条信号通路组成,其中JNK信号通路是一条主要的应激信号通路,在调控细胞的生长、凋亡和免疫反应等方面具有重要作用,但JNK信号的作用因细胞种类、刺激类型而有所差异。氧化应激下ATII细胞的凋亡(在肺损伤和纤维化中具有重要作用)可能涉及JNK信号,但JNK信号在其中起的作用尚不清除。目的1.采用过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)和无血清培养基建立原代大鼠ATII细胞的氧化损伤模型。2.研究H2O2对ATII细胞形态、存活和凋亡的影响,探讨细胞损伤与H2O2作用的浓度和时间效应关系。3.了解氧化应激下ATII细胞凋亡过程中JNK的活化情况,并采用JNK信号抑制剂预先干预,观察其是否能有效抑制H2O2诱导的JNK的活化,从而研究JNK对细胞凋亡的作用。方法分离、纯化清洁级Spraque-Dawley成年大鼠的ATⅡ细胞,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度。ATⅡ细胞用不同浓度的H2O2(0μM、50μM、100μM、500μM和1000μM)处理3 h;以500μM H2O2处理不同时间(0 h、1 h、3 h、6 h和9 h);采用倒置相差显微镜细胞形态变化,MTT比色法测定细胞存活率,流式细胞术定量检测凋亡率,以明确细胞损伤与H2O2作用的浓度和时间效应关系。500μM H2O2作用细胞3h后,透射电镜观察细胞凋亡改变。western blot检测500μM H2O2刺激ATⅡ细胞(0、5、10、30、60、180、360和540 min)后p-JNK的表达。在研究JNK信号作用时,细胞随机分为4组:以无血清培养基作用细胞3h,设为对照组(CON组);25μM SP600125(JNK信号特异性抑制剂)预处理,再以无血清培养基作用细胞3 h,设为CON+SP组;以500μM H2O2作用细胞3h,设为H2O2组;细胞预先加入25μM SP600125(JNK信号特异性抑制剂),再以500μM H2O2刺激3 h,设为H2O2+SP组,检测细胞的存活率和凋亡率;荧光显微镜观察荧光染料4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4’,6-Diamidino -2- phenylindole, DAPI)染色后细胞核的形态变化。结果1.不同浓度H2O2刺激ATⅡ细胞3 h后,与对照组(0μM H2O2)比较,10μM H2O2处理组的细胞生长形态无明显差异;100μM H2O2处理组细胞间隙稍增宽; 500μM H2O2处理组,细胞间隙增宽,体积略减小,部分细胞核浓缩变小,细胞内颗粒(板层小体)减少,1000μM H2O2处理时,大量细胞出现皱缩,变圆,可见细胞脱壁。在500μM H2O2作用细胞不同时间时,与对照组(0 h H2O2)比较,同样发现随处理时间的延长,细胞的形态损害随之加重。2.透射电镜观察发现500μM H2O2处理3 h后,部分细胞发生典型凋亡改变:细胞体积减小,胞质浓缩,胞膜内陷,多个凋亡小体围绕,小体内可见明显胞核物质。3.MTT实验结果表明:与对照组(0μM H2O2)相比,50μM、100μM H2O2处理对ATⅡ细胞存活率无明显影响(P > 0.05),500μM和1000μM H2O2处理后, ATⅡ细胞存活率呈下降明显(P < 0.05)。500μM H2O2处理不同时间后,与对照组(0 h H2O2)比较,随作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降,与对照组相比有显著差异(P < 0.05)。4.流式细胞术结果显示:与对照组(0 h H2O2)比较, 500μM H2O2处理ATⅡ细胞不同时间后,随H2O2作用时间的延长, ATⅡ细胞凋亡率呈明显上升趋势(P < 0.05)。5.500μM H2O2刺激后能很快激活JNK,p-JNK的表达在刺激30 min时表达最强,随后其表达逐渐减弱,SP600125预处理能有效抑制H2O2诱导JNK的活化。6.与H2O2组(500μM H2O2作用细胞3h组)比较,H2O2+SP组(SP600125预处理,再以500μM H2O2作用细胞3h组)细胞存活率上升而凋亡率下降(P均< 0.05)。7.荧光显微镜下发现DAPI染色后正常对照组ATⅡ细胞细胞核形态完整,发出浅蓝色荧光,H2O2组细胞多数细胞核浓集、固缩,发出明亮蓝色荧光,而H2O2+SP组细胞核的损伤较H2O2组减轻。结论1. H2O2以浓度和时间依赖的方式诱导ATⅡ细胞损伤。2.通过流式细胞仪和电镜证实:H2O2刺激可诱导ATⅡ细胞发生凋亡。3. JNK参与了氧化应激下ATⅡ细胞凋亡信号转导,并对ATⅡ细胞起促凋亡的作用。第三部分JNK对ATII细胞凋亡相关蛋白及核转录因子表达或活化的调控作用背景目前广泛认为在高氧暴露过程中产生的ROS是导致氧化应激性肺损伤的主要致病因素,ROS刺激可引起肺组织细胞的凋亡。近年来,ROS对细胞凋亡的调控作用逐渐引起人们的重视。ATⅡ细胞对维持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用,如果它过度凋亡,肺损伤和组织纤维化将不可避免。越来越多的研究者关注ATⅡ细胞的凋亡,但是氧化应激下ATⅡ细胞凋亡的机制尚不明确。第二部分证实了JNK信号通路参与了氧化应激下ATⅡ细胞凋亡信号转导并对ATⅡ细胞起促凋亡的作用,但JNK究竟通过哪些途径达到促细胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分进一步研究ROS对肺泡上皮细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响,并探索JNK信号对凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。目的1.观察ROS对ATⅡ细胞线粒体膜电位(Mitochondrial transmembrane potential, MMP)的损伤作用。2.研究ROS对肺泡上皮细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。3.使用JNK信号抑制剂SP600125,探索JNK信号对氧化应激下ATⅡ细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。方法Western blot法检测500μM H2O2刺激前后细胞凋亡相关蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和核转录因子NF-κB p65的表达,并采用SP600125阻断JNK信号活化后,研究JNK信号对以上蛋白表达或活化的影响。荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光染料JC-1染色后线粒体膜电位的变化。Mitotracker Red标记ATⅡ细胞线粒体,免疫荧光技术检测p53和NF-κB p65,激光共聚焦显微镜观察H2O2刺激前后p53和NF-κB的表达和分布情况。结果1. JC-1染色后,荧光显微镜下观察JC-1多聚体(红色荧光)和单体(绿色荧光)的变化情况,发现正常对照组细胞发出鲜艳的红色荧光,无绿色荧光,500μM H2O2刺激后,红色荧光逐渐暗淡,绿色荧光逐渐增强;流式细胞仪检测发现500μM H2O2刺激后,随作用时间的延长,红/绿荧光强度比值逐渐下降。2. Western blot检测发现,与正常对照组比较,500μM H2O2刺激后,随作用时间的延长,Bax、p53、active caspase-3和NF-κB p65的表达逐渐增加;SP600125预处理可明显降低H2O2刺激后以上相关蛋白的表达。3.激光共聚焦显微镜下观察发现正常对照组ATⅡ细胞p53和NF-κB p65的表达十分微弱,H2O2刺激后,p53和NF-κB p65的表达明显增加,并且它们都主要分布在细胞核内;SP600125预处理可明显降低H2O2刺激后p53和NF-κB p65的核内表达强度。结论1. H2O2刺激能破坏ATⅡ细胞线粒体膜电位,随刺激时间的延长,线粒体膜电位明显下降。2. H2O2刺激能通过JNK信号通路,明显上调凋亡相关蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和转录因子(NF-κB)的表达与活化,从而起到促细胞凋亡作用。第四部分NAC对氧化应激状态下肺泡II型上皮细胞的调控作用背景既然氧化应激下ROS对细胞的死亡起着关键作用,我们认为抗氧化处理可能有助于抑制氧化应激下ATΙΙ细胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)可作为还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione, GSH)合成的前体,在氧化应激下多种细胞的研究中已显示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC处理能否对氧化应激下ATΙΙ细胞起到保护作用。本研究探讨NAC对氧化应激下MAPKs激活的影响和ATΙΙ细胞的保护作用。目的1.研究NAC预处理能否对氧化应激下的ATⅡ细胞起保护作用。2.研究NAC预处理对H2O2刺激后ATⅡ细胞内ROS水平及MAPKs激活的影响。方法原代培养的大鼠ATⅡ细胞,随机分为4组:正常对照组(CON组)、CON+NAC组、H2O2组和H2O2+NAC组。MTT法检测各组细胞存活率的变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率和细胞内ROS水平。Western blot检测H2O2刺激及NAC干预后p-JNK、p-ERK和p-p38的表达的变化。结果1.与正常对照组比较, H2O2组细胞存活率明显下降(P < 0.05),细胞凋亡率明显上升(P < 0.05)。2.与正常对照组比较, H2O2组ATⅡ细胞内ROS水平上升(P < 0.05); H2O2刺激后p-JNK、p-ERK和p-p38的表达也明显增加(P<0.05)。3.与H2O2组比较,H2O2+NAC组细胞存活率明显升高(P < 0.05),凋亡率明显下降(P < 0.05)。4.与H2O2组比较,H2O2+NAC组细胞内ROS水平明显下降(P < 0.05),NAC预处理能明显抑制H2O2诱导的p-JNK、p-ERK和p-p38表达。结论氧化应激能激活包括JNK信号在内的MAPKs信号系统,上调ATⅡ细胞内的ROS水平,并诱导ATⅡ细胞凋亡;NAC通过降低细胞内ROS和抑制包括JNK在内的MAPKs的活化,减轻氧化应激下ATⅡ细胞的凋亡而对ATⅡ细胞起保护作用。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-8
中文摘要  8-19
英文摘要  19-31
论文正文氧化应激下肺泡II 型上皮细胞凋亡和JNK 的调控机制  31-133
  前言  31-34
  第一部分原代大鼠肺泡II 型上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定  34-51
    1 材料与方法  35-42
    2 实验结果  42-43
    3 讨论  43-45
    4 结论  45-46
    参考文献  46-48
    图片资料  48-51
  第二部分氧化应激对肺泡II 型上皮细胞的损伤作用及JNK 调控作用  51-86
    1 材料与方法  52-65
    2 实验结果  65-74
    3 讨论  74-78
    4 结论  78-79
    参考文献  79-82
    图片资料  82-86
  第三部分 JNK 对氧化应激状态下肺泡II 型上皮细胞凋亡相关蛋白及核转录因子表达或活化的调控作用  86-116
    1 材料与方法  87-91
    2 实验结果  91-100
    3 讨论  100-107
    4 结论  107-108
    参考文献  108-113
    图片资料  113-116
  第四部分 NAC 对氧化应激状态下肺泡II 型上皮细胞的调控作用  116-132
    1 材料与方法  117-120
    2 实验结果  120-125
    3 讨论  125-128
    4 结论  128-129
    参考文献  129-132
  研究展望  132-133
文献综述（一）  133-142
文献综述（二）  142-149
致谢  149-150
攻读学位期间文章发表和学术活动  150

氧化应激下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和JNK的调控机制

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