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草莓基因组中LTR反转录转座子的分离和鉴定

作　者: 马跃
导　师: 张志宏
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 果树学
关键词: 草莓 反转录转座子 序列比对 系统进化分析 转录活性
分类号: S668.4
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


草莓是无性繁殖的蔷薇科草本植物,近年来国内草莓生产发展很快。随着植物组织培养技术在草莓上的广泛应用,生产中发现一些草莓微繁殖苗表现体细胞无性系变异现象。转座元件的激活是体细胞无性系变异的一个重要原因,本文首次从八倍体栽培草莓,二倍体、四倍体野生草莓基因组中分离了Ty1-copia组反转录转座子的RT基因序列;对来自不同倍性草莓的Ty1-copia组反转录转座子的RT基因序列,进行了系统进化分析;同时从八倍体栽培草莓基因组中分离了Ty3-gypsy组反转录转座子的RT基因序列并对八倍体草莓基因组中的Ty1-copia、Ty3-gypsy组反转录转座子的拷贝数和转录活性进行了分析。主要结果如下:1.采用PCR简并引物扩增的方法从八倍体栽培草莓基因组中分离出了19条独立的Ty1组反转录转座子RT序列,这些序列推测的氨基酸序列的异质性为1.15%～70%,其中含有终止密码子和移码现象的有5条,余下的14条具有潜在转座活性。基于这19条独立氨基酸序列的系统进化分析,将它们分为7组,其中第1组全部含有终止密码子序列。从二倍体野生草莓基因组中分离出34条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列,推测的氨基酸序列的异质性为2.3%～55.06%,其中含有终止密码子12条,余下的22条为有潜在转座活性的序列。将二倍体草莓中分离的34条独立序列进行系统进化分析,共分为7组,其中第7组全部含有终止密码子序列。从四倍体野生草莓基因组中分离出13条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列,推测的氨基酸序列的异质性为1.12%～55.06%,其中含有终止密码子2条,余下的11条为有潜在转座活性的序列。将四倍体草莓中分离的13条独立序列进行系统进化分析,共分为4组,其中第4组全部为含有终止密码子。2.在八倍体栽培草莓基因组中分离出了10条独立的Ty3-gypsy组反转录转座子RT基因序列,推测的氨基酸序列的异质性为1%～30%,其中含有终止密码子的2条,序列不完整的2条,余下的6条为有潜在转座活性的序列。将八倍体草莓中分离的10条独立Ty3-gyps组反转录转座子RT序列进行系统进化分析,共分为2组。3.通过对八倍体栽培草莓、二倍体野生草莓和四倍体野生草莓的Ty1-copiae组反转录转座子RT序列进行系统进化分析发现:二倍体绿色草莓（Fragaria viridis Duch）与四倍体东方草莓（Fragaria orientalis Lozinsk）的亲缘关系相对其它种近:来自森林草莓（Fragaria vesca Duch）的一条Ty1-copia组反转录转座子RT序列wd3-1是本研究所分离的各类草莓Ty1组反转录转座子序列中最古老的一条。4.采用Southeron斑点杂交估测出Ty1-copia和Ty3-gyps组反转录转座子在八倍体栽培草莓基因组中的拷贝数分别是2875,348。两种LTR类反转录转座子占整个八倍体栽培草莓基因组的15.8%,其中Ty1-copia组反转录转座子在基因组中的比例为13.5%,大于Ty3-gyps组的2.3%。5.通过RT-PCR技术检测不同处理对八倍体草莓中两种LTR反转录转座子转录活性的影响,结果显示:在常规大田植株和组织培养继代植株中都没有发现有转录活性的LTR类反转录转座子;在MS+6-BA 0.5mg·L-1+GA3 0.5mg·L-1+TDZ2.0 mg·L-1+IBA0.02mg·L-1和MS+6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.5mg·L-1+TDZ 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1mg·L-1两种再生培养基诱导的草莓愈伤组织中检测到有转录活性的Ty1-copia组反转录转座子;在分别用2 mM水杨酸、50 mM茉莉酮酸甲酯、50 mM脱落酸、50 mM 2,4-D,处理了16 h后的大田草莓叶片中,检测到Ty1-copia组反转录转座子转录活性。6.发生转录的22条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列中,ys11-11,ys11-27和xp4-2与其它序列差别较大,其余的19条序列异质程度为1%～6.51%,明显低于从草莓基因组中分离的Ty1-copia组反转录转座子RT序列。

全文目录


摘要  11-13
Abstract  13-15
第一章 前言  15-28
  1.1 LTR类反转录转座子的类型、结构特点和转座机制  15-17
    1.1.1 LTR类反转录转座子的类型  15
    1.1.2 LTR类反转录转座子的结构特点  15-16
    1.1.3 LTR类反转录转座子的转座机制  16-17
  1.2 LTR反转录转座子的特性  17-20
    1.2.1 广泛存在于高等生物基因组中  17
    1.2.2 高拷贝性  17-18
    1.2.3 高异质性  18-20
    1.2.4 垂直传递和水平传递  20
  1.3 反转录转座子的活性及其对基因组的影响  20-23
    1.3.1 反转录转座子的活性  20-22
    1.3.2 反转录转座子的活性及其对基因组的影响  22-23
  1.4 植物反转录转座子在功能基因组学中的应用  23-24
  1.5 基于反转录转座子的分子标记类型及其应用  24-27
    1.5.1 序列特异扩增多态性  25
    1.5.2 反转录转座子位点间扩增多态性  25-26
    1.5.3 反转录转座子微卫星扩增多态性  26
    1.5.4 基于反转录转座子插入多态性  26-27
  1.6 本研究的目的意义  27-28
第二章 草莓基因组中LTR反转录转座子的分离  28-54
  2.1 材料与方法  28-32
    2.1.1 植物材料  28
    2.1.2 引物  28-29
    2.1.3 草莓叶片总DNA的提取及检测  29-30
    2.1.4 PCR反应  30
    2.1.5 PCR特异DNA片段的回收  30
    2.1.6 PCR产物克隆测序  30-32
    2.1.7 序列比较与分析  32
  2.2 结果与分析  32-49
    2.2.1 草莓DNA的质量和完整性的检测  32-33
    2.2.2 RT基因PCR扩增体系的优化  33-37
    2.2.3 序列比对和系统进化分析  37-49
  2.3 讨论  49-52
    2.3.1 TyI组反转录转座子PCR扩增中的假阳性现象  49-50
    2.3.2 LTR反转录转座子的异质性  50-51
    2.3.3 草莓种间亲缘关系及进化  51-52
  2.4 小结  52-54
第三章 草莓基因组中LTR反转录转座子的拷贝数及其在基因组中所占比例的分析  54-67
  3.1 材料与方法  54-59
    3.1.1 植物材料  54
    3.1.2 草莓基因组模板DNA的制备  54-55
    3.1.3 草莓叶片总DNA的检测  55
    3.1.4 DNA斑点印迹  55-56
    3.1.5 DNA的交联  56
    3.1.6 杂交探针的制备  56
    3.1.7 Southern斑点杂交  56-58
    3.1.8 洗膜  58-59
    3.1.9 杂交信号的获得  59
  3.2 结果与分析  59-63
    3.2.1 总DNA样品的质量、浓度和完整性检测  59-61
    3.2.2 探针的制备  61-62
    3.2.3 Southern斑点杂交结果与拷贝数的计算  62-63
  3.3 讨论  63-66
    3.3.1 用于印迹的总DNA质量  63-64
    3.3.2 杂交信号强弱的分析  64-65
    3.3.3 草莓基因组中存在高拷贝的Ty1组和Ty3组反转录转座子  65-66
  3.4 小结  66-67
第四章 草莓基因组中LTR反转录转座子转录活性分析  67-83
  4.1 材料和方法  67-70
    4.1.1 植物材料  67
    4.1.2 愈伤组织的诱导  67-68
    4.1.3 激素处理叶片  68
    4.1.4 草莓叶片总RNA的提取及检测  68-69
    4.1.5 RT-PCR  69-70
    4.1.6 PCR产物特异DNA片段的回收  70
    4.1.7 PCR产物克隆测序  70
    4.1.8 序列比较与分析  70
  4.2 结果与分析  70-80
    4.2.1 RNA的质量和完整性的检测  70-71
    4.2.2 RT-PCR对表达活性的检测  71-75
    4.2.3 序列比对和系统进化分析  75-80
  4.3 讨论  80-82
    4.3.1 DNA污染对RT-PCR反应的影响  80-81
    4.3.2 胁迫激活反转录转座子的转录活性  81
    4.3.3 草莓中有转录活性的Ty1组反转录转座子RT序列的进化分析  81-82
  4.4 小结  82-83
第五章 结论及创新点  83-85
  5.1 结论  83
  5.2 创新点  83
  5.3 下一步研究设想  83-85
参考文献  85-94
附录  94-95
攻读博士期间发表的文章  95-96
致谢  96

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 草莓
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