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RAPD研究紫外诱变后的链霉菌AP19-1基因组DNA突变

作　者: 李欧
导　师: 吴雪昌
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: 链霉菌 RAPD 条件优化 紫外诱变 序列比对
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 165次
引　用: 2次
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内容摘要


随机扩增多态性DNA（RAPD）利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物,以研究对象的基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过扩增产物DNA片段的多态性来检测基因组DNA的多态性。然而,由于RAPD分析重复性较差和存在假带现象,如果没有一个统一的优化条件,将导致试验结果的失真。通过对Mg2+、dNTP、模板浓度、引物浓度、‘Taq酶浓度等反应体系进行浓度梯度研究及对退火温度、退火至延伸时的ramp速度、循环次数等反应条件进行优化。找出本实验室条件下的链霉菌APl9-1的最佳RAPD扩增条件:扩增反应的总体积为20gl,其中包括1×buffer,3.OmM MgCl2 400μM dNTP,0.4m引物,2.5UT aq酶及200ng模板DNA,扩增程序为94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,36.4℃退火30秒,72℃延伸2分钟,共40个循环,最后在70℃延伸10分钟。其中从退火到延伸的ramp时间为108秒。在获得的最佳扩增条件的基础上,利用50种RAPD随机引物对野生型菌株及紫外诱变后得到的高产菌株进行RAPD比较分析。发现引物BAO22能检测出高产菌株与野生株差异,即高产株出现了两条特异性的条带,其大小分别为480bp和570bp左右。回收特异性条带,经T—A克隆后测序,用BLAST程序在NCBI上进行比对,发现480bp左右的条带与一种产志贺毒素（shiga toxin）的大肠杆菌的毒力岛基因簇中的一段基因间序列有100%的相似性。推测此序列可能与APl9—1的抗生素相关基因的调控有关。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-7
前言  7-11
材料与方法  11-21
  1．菌株  11
  2．培养基和试剂  11-13
  3．主要仪器设备  13-14
  4．菌株AP19-1诱变育种  14-15
    4．1 链霉菌孢子悬液的制备  14
    4．2 孢子的紫外诱变  14
    4．3 菌种的发酵  14
    4．4 抗生素效价测定  14-15
    4．5 诱变菌株的筛选  15
  5．RAPD扩增条件的优化  15-16
    5．1 链霉菌基因组DNA的提取  15
    5．2 RAPD引物的筛选检测  15
    5．3 RAPD条件的优化  15-16
  6．野生型、高产菌株的比较分析  16
  7．特异性片断的割胶回收  16-17
  8．T-A克隆  17
  9．感受态的制备及转化  17-18
    9．1 感受态的制备  17-18
    9．2 转化  18
  10．转化产物的鉴定  18-20
    10．1 菌落PCR检测  19
    10．2 双酶切检测  19-20
  11．测序  20-21
结果  21-35
  1．链霉菌AP19-1 RAPD条件的优化  21-29
    1．1 不同的模板DNA浓度对RAPD扩增的影响  21-22
    1．2 不同的Mg~(2+)浓度对RAPD条带的影响  22-23
    1．3 不同的dNTP浓度对RAPD扩增的影响  23-24
    1．4 不同的引物浓度对RAPD扩增的影响  24-25
    1．5 不同的Taq酶浓度对RAPD扩增的影响  25-26
    1．6 不同的退火温度对RAPD扩增的影响  26-27
    1．7 不同的ramp时间对RAPD扩增的影响  27-28
    1．8 不同的循环数对RAPD扩增的影响  28-29
  2．野生型及诱变后的高产菌株的RAPD条带的比较分析及差异性条带的回收了T—A克隆  29-30
    2．1 野生型对照、高产菌株的RAPD比较验证基因组的改变  29
    2．2 菌落PCR及双酶切验证T-A克隆的结果  29-30
  3．RAPD差异性条带的测序及序列的比对分析  30-31
    3．1 序列1  30-31
    3．2 序列2  31
  4．其它序列比对分析辅助种的确定  31-35
    4．1 序列3  31-33
    4．2 其它经比对暂时无同源序列的序列  33-35
讨论  35-40
  1．RAPD的优化  35-37
    1．1 反应体系的优化  35-36
    1．2 RAPD-PCR扩增程序的优化  36-37
  2．RAPD法来检测高产菌株的突变  37-38
  3．特异性序列比对结果初步分析  38-39
  4．其它序列比对结果的初步分析  39-40
结束语  40-41
综述  41-52
参考文献(Reference)  52-59
致谢  59

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物遗传学
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