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miR-483和miR-34a功能研究

作　者: 孙芳
导　师: 孙志贤；郑晓飞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: miR-483 miR-34a 类胰岛素生长因子2 类胰岛素生长因子结合蛋白细胞周期蛋白D1 细胞周期蛋白依赖性激酶6
分类号: Q343
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

microRNA(miRNA)是一类长度为20-25nt,从发夹结构前体加工而来的具有基因调控功能的小分子非编码RNA。研究表明,miRNA主要是通过抑制靶基因的翻译或介导靶基因mRNA的降解在真核基因表达的转录后调控过程中发挥重要作用,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等过程。新的研究证明,miRNA与细胞的癌变及多种肿瘤的发生有着极为密切的关系。半数以上的miRNA基因位于肿瘤细胞的基因组易变异的区域,包括等位基因的杂合性丢失(LOH)区、基因组断裂点(break point)和脆性位点(fragile sites,FRT)等,这些部位常常是癌细胞染色体交换、转位、缺失、扩增或基因异常整合的区域。首先,为研究miRNA在肝脏中的重要作用,揭示相关miRNA在肝细胞增殖癌变中对基因表达调控的作用机制,我们利用本实验室建立的miRNA基因克隆方法,从人胎肝组织中克隆得到5条新的miRNA基因,经分析我们发现其中一条miR-483位于类胰岛素生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)的第7内含子。IGF2是一种多功能细胞增殖调控因子,它在胚胎发育、中枢神经系统发育及肿瘤细胞增殖等方面具有重要的生物学功能。IGF的生物学活性受到包括类胰岛素生长因子不同类型的受体、类胰岛素结合蛋白及类胰岛素结合相关蛋白等多因素参与的复杂的调控网络调控。为了进一步揭示miR-483在肝细胞增殖癌变中的作用及miR-483在IGF2增殖调控通路中的机制,我们验证了miR-483与IGF2的表达相关性并对miR-483的靶基因进行了预测和筛选,以期揭示miR-483在肝细胞增殖调控中的功能意义。其次,本研究同时关注了近来发现的在肿瘤细胞周期调控中发挥重要功能的miR-34a分子。研究结果表明,miR-34a可通过负调控多个细胞周期相关基因的表达,诱导细胞周期的阻滞,这提示miR-34a可能具有肿瘤抑制因子的功能活性。取得的主要进展有:1.在肝癌细胞和肝癌组织中miR-483与其宿主基因IGF2是协同表达的。检测了9例肝癌组织和3种人肝癌细胞系中miR-483和其宿主基因IGF2的表达。在肝癌HepG2、BEL-7402和SMMC-7721中miR-483和IGF2均有表达;在9例肝癌病人癌组织及癌旁组织中,有4例肝癌组织中IGF2表达水平较高,在IGF2高表达的肝癌组织中miR-483表达水平较癌旁组织高。研究结果同时显示,在肝癌组织中IGF2的过量表达主要是由于胚胎性启动子P3和P4生成的转录本异常高表达所致。2.在不同类型细胞中,miR-483与其宿主基因的表达水平不完全一致,可能其表达加工过程受到不同因素的调控。结果表明,在人胚肾HEK293细胞中IGF2表达水平很高,且miR-483的前体pre-miR-483大量表达,但成熟体miR-483几乎检测不到;在慢性淋巴性白血病K562细胞中IGF2有表达,miR-483表达较弱;在人宫颈癌HeLa细胞中IGF2表达很弱,然而miR-483却有一定水平的表达。初步研究表明可能存在一些细胞特异性的能结合前体pre-miR-483的因子调控着miR-483的加工成熟。3. miR-483通过负调控IGFBP3参与了IGF2介导的对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的调控。克隆并构建了miR-483的真核表达载体,筛选得到了稳定表达miR-483的HepG2细胞模型。利用该模型细胞经基因芯片检测和生物信息学技术,分析并证实了miR-483可以下调IGFBP3 mRNA及蛋白水平的表达,抑制miR-483后IGFBP3蛋白水平的表达相应上调。过表达miR-483可以抑制ATRA诱导的IGFBP3的表达,并使ATRA诱导的HepG2细胞增殖和细胞凋亡能力受到抑制。4. miR-34a通过负调控CCND1和CDK6的表达诱导G1期阻滞。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-34a可以直接作用于CCND1和CDK6的3′UTR区。过表达miR-34a可以显著抑制肺癌A549细胞内源CCND1和CDK6蛋白的表达并影响其mRNA的稳定性。miR-34a可以通过协同调控多个周期相关基因参与细胞周期调控和肿瘤细胞增殖过程。综上,本研究揭示了miR-483在肝癌增殖调控中促进细胞增殖抑制凋亡的重要作用,同时阐明了miR-34a可以通过协同调控多个周期相关基因参与细胞周期调控的机制。

全文目录

缩略语一览表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-20
  一、miRNA 的生物发生和功能  11-13
  二、 miRNA 与肿瘤  13-15
  三、miRNA 应用于疾病治疗的现状和前景  15-17
  参考文献  17-20
第一部分 miR-483 与宿主基因IGF2 表达关系分析  20-38
  实验材料  20-22
  实验方法  22-27
  结果  27-32
  讨论  32-35
  小结  35-36
  参考文献  36-38
第二部分 miR-483 靶基因筛选及其在肝癌增殖调控中的功能研究  38-66
  实验材料  38-41
  实验方法  41-49
  结果  49-56
  讨论  56-62
  小结  62
  参考文献  62-66
第三部分 miR-34a 调控肿瘤细胞周期相关基因功能研究  66-80
  实验材料  66-69
  实验方法  69-70
  结果  70-76
  讨论  76-78
  小结  78
  参考文献  78-80
总结  80-81
附录1 实验设备及仪器  81-82
附录2 个人简历  82-84
致谢  84

miR-483和miR-34a功能研究

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