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番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立

作　者: 洪薇
导　师: 曹家树；郑重
学　校: 浙江大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄 Lycopersicon esculentum 叶霉病 Cladosporium fulvum 抗病基因 Cf 无毒基因 Avr 过敏性坏死(HR) 发育温度 cDNA-AFLP 基因表达 TRV 病毒介导的基因沉默(VIGS) ACE ACI 60S核糖体蛋白L10 类似钙调磷酸酶的磷酸酯酶
分类号: S436.412
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)对叶霉病(Cladosporium fulvum)的抗性是番茄抗C.fulvum基因(Cf)和互补的C.fulvum无毒基因(Avr)产物进行识别互作,激活下游抗病信号传导,并活化各类防卫反应基因表达的结果。Cf-9与Cf-4蛋白的氨基酸序列91%以上一致,而Avr9与Avr4则没有明显的同源性,Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4介导的过敏性坏死(hypersensitive response,HR)在坏死产生时间、方式和强度上表现明显差异。Avr9/Cf-9番茄苗中HR产生早,扩展慢,产生的过敏性坏死斑小而多,分散,在叶脉上较少见。而Avr4/Cf-4苗中HR产生迟,扩展快,产生的过敏性坏死斑少,多产生于主脉,常沿叶脉迅速扩大成坏死区,最终导致整个子叶的萎蔫脱落。导致两种Avr/Cf苗产生不同HR的原因,可能是Cf表达的差异,和/或Cf下游信号传导途径的差异。本研究以通过杂交获得的携带Avr9/Cf-9或Avr4/Cf-4基因对的番茄为材料,观察降温过程中Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4番茄幼苗子叶HR坏死产生过程的异同;通过cDNA-AFLP分析,比较和分离克隆Cf-9和Cf-4下游信号传导相关基因(片段),并对分离到的部分相关基因进行功能分析,建立对cDNA-AFLP片段直接进行抗病相关性验证的TRV介导的VIGS分析体系;比较分析植株发育、温度以及互补无毒基因对Cf-9和Cf-4基因表达的影响;以便增进对Cf-9和Cf-4介导HR和抗病性产生的分子机理的理解,并为采用基于cDNA-AFLP片段的基因沉默技术快速大量分离鉴定植物抗病相关基因奠定基础。获得的主要研究结果如下:(1)对Avr/Cf番茄幼苗产生HR的特性进行显微观察和比较分析,发现高温33℃抑制Avr/Cf番茄中HR的产生,5 d苗龄的Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4幼苗从33℃降温到20℃培养后4h和16h有少许细胞被锥虫蓝染成蓝色,两者分别在降温12h和48h后大片组织被染成蓝色,说明Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4番茄苗分别于降温后4h和16h后开始产生HR,至12h和48h形成典型HR。(2)采用上述Avr/Cf番茄苗通过温控产生HR的系统,对分别为Avr4、Cf-4、Avr4/Cf-4、Avr9、Cf-9、Avr9/Cf-9的6个基因型番茄苗经高温和降温处理后所取样品进行cDNA-AFLP分析。通过512对选扩组合对12个样品共得到279 480个明显cDNA-AFLP条带,其中表现和不表现HR时差异表达的ACE(Avr/Cf-elicited,either induced or repressed)条带为367个。在这些差异表达条带中,249个为Avr4/Cf-4和Avr9/Cf-9番茄苗产生HR时均诱导表达,118个为产生HR时表达均受抑制。共克隆差异表达最显著的序列189个,均已登录GenBank核酸序列数据库,登录号分别为CD579099～CD579164,CK348286～CK348390,以及DN956215～DN956225。这些差异表达片段对应基因分别编码抗病蛋白,以及与HR/细胞坏死、信号传导、防卫反应、转录调节、代谢,和蛋白合成等相关因子。此外,共获得cDNA全长序列9个,因其皆为Avr/Cf诱导表达,故称为ACI(Avr/Cf-induced)基因,登录号分别为DQ056433～DQ056442。其中,ACI14编码钙调磷酸酶类磷酸酯酶(calcineurin-like phosphoesterase family protein),ACI25编码木葡聚糖特异性真菌内源葡聚糖酶抑制子蛋白(xyloglucan-specific fungal endoglucanase inhibitor protein),ACI29编码60S核糖体蛋白L10,ACI36编码酮戊二酸/苹果酸转运蛋白(oxoglutarate/malate translocator),ACI37编码细胞色素b559,ACI39编码胞质核糖体蛋白S13,而ACI13,ACI19和ACI112编码功能未知的蛋白。cDNA-AFLP差异显示结果表明,虽然367个ACE片段在Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4苗中表现与不表现HR时差异表达的趋势(即同样被HR诱导或抑制)一致,但其中42.8%(157/367)ACE片段在两类HR中差异表达的强度不同,绝大多数(135/157,86.0%)在Avr4/Cf-4苗中差异表达程度更显著。这些结果说明,Cf-4和Cf-9下游信号传导途径涉及的基因很可能一致,但它们表达的精细调控可能有一定区别。(3)对ACI29在HR产生前后和胁迫处理后的表达进行分析,发现在只含Avr9、Cf-9、Avr4或Cf-4基因不产生HR的番茄苗中,ACI29在苗龄为3d及以前的小苗中微弱表达,但在4d后表达明显增强。在有互补Avr/Cf基因对存在因而产生HR的幼苗中,ACI29表达比上述对照强,且Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4番茄苗之间,ACI29表达时序和强度都有明显差异,在Avr9/Cf-9幼苗中的表达早于Avr4/Cf-4幼苗,但在Avr4/Cf-4苗HR产生后,ACI29的表达比同样大小的Avr9╱Cf-9苗中更强烈。说明ACI29表达与植株的发育和过敏性坏死程度相关。另外,重金属离子处理微弱诱导ACI29的表达。盐渍和干旱强烈抑制其表达,而机械损伤处理后的表达与未处理的对照相当。这说明60S核糖体蛋白L10可能参与植物的发育、HR和逆境反应的调控。(4)分别将差异片段29和14亚克隆入TRV介导的基因沉默载体pYL156,以番茄tPDS基因的VIGS沉默体系为对照,对Cf-9和Cf-4基因型植株进行沉默分析,发现正对照植株表现白化症状,说明植株体内tPDS基因已被沉默。片段29沉默后出现严重的发育迟缓和矮化现象,而片段14沉默后没有发现明显症状。这说明核糖体蛋白编码基因ACI29可能参与植株的发育调控,而编码类似钙调磷酸酶的磷酸酯酶编码基因ACI14则可能与发育无关。采用基于cDNA-AFLP片段的基因沉默技术快速大量分离鉴定植物抗病相关基因的策略是可行的。(5)分别对cf-9、Avr9/Cf-9、Cf-4和Avr4/Cf-4基因型番茄幼苗在1d、3d和5d的高温培养后进行降温处理,经Northern杂交分析表明,在不存在互补无毒基因的情况下,Cf-9在各处理中均未见表达,而Cf-4的表达量则随着幼苗培育天数和降温时间的延长而增加;当互补无毒基因存在时,Cf基因的表达强于只含Avr或Cf的对照小苗。两者的表达均随幼苗培育天数和降温时间的的延长而迅速增加。降温处理后,Cf-9进入大量表达的时期早于Cf-4,但Cf-4的表达峰值明显高于前者。这说明发育、温度和无毒基因与Cf基因的表达密切相关,且Cf-9和Cf-4对这些因子影响的反应无论从时序上还是强度上均有区别。

全文目录

致谢  6-10
缩写词(Abbreviation)  10-13
摘要  13-15
Abstract  15-18
前言  18-22
1 文献综述  22-40
  1.1 番茄与叶霉菌互作机理的研究进展  22-29
    1.1.1 番茄和C.fulvum的亲和互作  22
    1.1.2 番茄和C.fulvum的非亲和互作  22
    1.1.3 C.fulvum的致病性和毒性因子  22-23
    1.1.4 番茄和C.fulvum非亲和互作的分子生物学  23-29
  1.2 cDNA-AFLP技术的原理及其应用  29-33
    1.2.1 cDNA-AFLP技术的原理与方法  30
    1.2.2 cDNA-AFLP技术的优点  30-31
    1.2.3 cDNA-AFLP技术的应用  31-33
    1.2.4 cDNA-AFLP技术的发展  33
  1.3 病毒诱导基因沉默的原理、方法与应用  33-40
    1.3.1 VIGS作用的机理  33-34
    1.3.2 VIGS技术的发展  34-35
    1.3.3 VIGS操作方法及其关键影响因子  35-36
    1.3.4 VIGS技术的优点  36-37
    1.3.5 VIGS技术在植物病理学研究中的应用  37-40
2 Avr/Cf基因型番茄苗降温处理后过敏性坏死的显微观察  40-46
  2.1 材料与方法  40-41
    2.1.1 植株培养及采样  40-41
    2.1.2 锥虫蓝染色  41
  2.2 结果与分析  41-44
  2.3 讨论  44-46
3 番茄Cf-4和Cf-9介导的抗病信号传导途径相关基因表达的cDNA-AFLP分析  46-98
  3.1 材料与方法  47-55
    3.1.1 植株培养及取样  47
    3.1.2 总RNA提取  47-48
    3.1.3 cDNA-AFLP  48-51
    3.1.4 差异表达片段的回收、克隆与测序  51-52
    3.1.5 Reverse Northern杂交分析  52-53
    3.1.6 Northern杂交分析  53
    3.1.7 差异表达片段全长cDNA序列的扩增  53-55
    3.1.8 序列分析  55
  3.2 结果与分析  55-83
    3.2.1 不同基因型番茄幼苗产生HR的情况  55
    3.2.2 cDNA合成及预扩  55
    3.2.3 cDNA-AFLP差异显示  55-56
    3.2.4 差异TDFs的克隆、测序和序列分析  56-57
    3.2.5 差异表达片段的Reverse Northern检测  57-61
    3.2.6 典型差异表达片段的Northern验证  61
    3.2.7 部分差异片段全长序列获取以及序列分析  61-73
    3.2.8 差异片段全长序列分析  73-83
  3.3 讨论  83-98
    3.3.1 Cf-4和Cf-9信号传导途径的比较  83
    3.3.2 Cf-4和Cf-9介导的抗病性激发的基因转录本积累水平改变  83
    3.3.3 适合cDNA-AFLP分析的HR产生材料系统  83-84
    3.3.4 通过cDNA-AFLP分析植物抗病性的优点  84
    3.3.5 番茄EST资源的利用  84-98
4 HR和逆境条件下ACI29的表达分析  98-102
  4.1 材料与方法  98-99
    4.1.1 植株培养及取样  98
    4.1.2 总RNA提取  98
    4.1.3 Northern杂交  98-99
  4.2 结果与分析  99-100
    4.2.1 ACI29在Avr9、Cf-9、Avr4或Cf-4番茄苗中的表达差异  99
    4.2.2 ACI29在不同胁迫处理后的表达有显著差异  99-100
  4.3 讨论  100-102
    4.3.1 ACI29基因可能与植株发育有关并参与Cf介导的HR的调控  100
    4.3.2 ACI29可能参与对胁迫反应的调节  100-102
5 差异表达片段TDF29和TDF14的基因沉默分析  102-106
  5.1 材料与方法  102-103
    5.1.1 重组pYL156基因沉默载体的构建  102-103
    5.1.2 农杆菌接种和接种后植株的培养  103
  5.2 结果与分析  103-104
  5.3 讨论  104-106
6 番茄发育过程中互补无毒基因和温度对抗叶霉菌基因Cf-9和Cf-4表达的影响  106-112
  6.1 材料与方法  106
    6.1.1 植株培养及取样  106
    6.1.2 总RNA提取  106
    6.1.3 Northern杂交  106
  6.2 结果与分析  106-108
  6.3 讨论  108-112
    6.3.1 Avr9基因和温度显著影响Cf-9基因的表达  109
    6.3.2 在植株不同发育时期,温度对Cf-9基因和Cf-4基因表达的影响程度不同  109
    6.3.3 无毒基因对Cf-9和Cf-4表达的影响程度不同  109-110
    6.3.4 Cf基因表达与Avr/Cf番茄幼苗中HR的产生和发展呈密切正相关  110-112
结论  112-114
参考文献  114-122

番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立

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