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盐胁迫下红树植物—角果木耐盐生理及分子基础研究

作　者: 符秀梅
导　师: 杨好伟；陈银华
学　校: 海南大学
专　业: 植物学
关键词: 角果木耐盐显微结构抗氧化生理渗透调节 cDNA-AFLP
分类号: Q945.78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

红树是生长在热带、亚热带海岸潮间带的木本挺水植物,长期生长于高盐生境使红树植物具有一套独特的耐盐机制。本研究以红树科植物角果木(Ceriops tagal (Perr.) C.B.Rob.)为研究对象,从根的显微结构、生理变化、基因表达变化等3个方面对角果木的耐盐机理进行探索。主要结果如下：1、角果木幼苗在不同浓度处理一个月后,根尖的中柱鞘变得不明显,且盐浓度越大,中柱鞘越不明显,从而盐胁迫影响了角果木侧根的发生。盐胁迫对角果木根尖皮层也有较大影响：高盐(500 mmol·L-1)胁迫下,角果木根尖外皮层、内皮层明显增厚,以阻止有害离了进入。2、盐胁迫下,同一处理时间点随着盐浓度的增加角果木根部总蛋白含量下降,但随处理时间的延长各盐处理下的总蛋白含量与对照组的差异逐渐缩小,且在24h后略高于对照组,说明角果木在适应盐环境的过程中有新的蛋白产生。3、植物受到盐胁迫后会立即引起氧化胁迫,产生氧化胁迫后就导致膜脂过氧化,因此早期(≦9h) MDA含量急剧上升,这种信号的出现诱导植物中抗氧化防御系统的启动,相关酶的表达。因此在24h内各盐处理前期,角果木根部抗氧化酶类及抗氧化物质均有所增加,而处理24 h后,角果木根部MDA含量、ASA含量、POD活性以及SOD活性均恢复至对照水平,表明角果木在受盐胁迫后通过启动抗氧化酶类、抗氧化物质以清除活性氧对根部的损伤,而后开始适应外界盐环境。4、在高盐(500 mmol·L-1)胁迫下,角果木根部可溶性糖含量和Pro含量在盐胁迫前期(≦72h)均有所增加,而在72h后均处于稳定状态,而多酚含量在盐胁迫初期(≦24h)有所下降,之后也处于稳定状态。表明角果木在高盐胁迫下,在对盐渍的适应过程中需要渗透调节物质进行调节,当角果木适应外界盐环境后,这些渗透调节物质便趋于稳定。5、利用cDNA-AFLP技术筛选得到69个差异片段,经克隆测序及RT-PCR验证后,筛选获得61个差异片段。对所得到的61个差异片段进行生物信息学分析,经blastx功能分析后,得到38个已知基因,这38个基因按功能分为8大类,由此说明角果木在盐胁迫条件下要涉及大量的基因参与各种代谢途径。对角果木用不同盐浓度处理不同时间,通过半定量RT-PCR技术进行差异表达基因在盐胁迫下的表达谱分析,证实了所获得的基因序列是真正的诱导表达序列。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-14
  1.1 逆境胁迫对盐生植物根显微结构的影响  9
  1.2 盐生植物对盐胁迫的适应机制  9-12
    1.2.1 形态适应机制  10
    1.2.2 离子平衡机制  10
    1.2.3 渗透调节机制  10-11
    1.2.4 活性氧的清除机制  11-12
    1.2.5 分子水平的耐盐性  12
  1.3 cDNA-AFLP技术在植物基因差异表达分析上的应用  12-13
  1.4 本研究的目的意义和技术路线  13-14
2 角果木在盐胁迫下根尖显微结构的变化  14-18
  2.1 实验材料与方法  14-16
    2.1.1 植物材料  14
    2.1.2 实验仪器及试剂  14-15
    2.1.3 实验方法  15-16
  2.2 结果分析  16-18
  2.3 讨论  18
  2.4 结论  18
3 盐胁迫对角果木根系生理生化的影响  18-35
  3.1 角果木细胞中氧自由基代谢的影响  18-24
    3.1.1 实验材料与方法  18-24
      3.1.1.1 植物材料  18-19
      3.1.1.2 实验方法  19-24
        3.1.1.2.1 根系蛋白质总含量的测定  19-20
        3.1.1.2.2 根系过氧化物酶(POD)活性测定  20-21
        3.1.1.2.3 超氧化物岐化酶(SOD)活性测定  21-22
        3.1.1.2.4 细胞内的还原型抗坏血酸(ASA)含量测定  22-23
        3.1.1.2.5 丙二醛(MDA)含量测定  23-24
  3.2 角果木耐盐过程中渗透调节机制的影响  24-35
    3.2.1 实验材料与方法  24-26
      3.2.1.1 植物材料  24
      3.2.1.2 实验方法  24-26
        3.2.1.2.1 可溶性糖含量的测定  24
        3.2.1.2.2 游离脯氨酸含量的测定  24-25
        3.2.1.2.3 多酚类物质含量测定  25-26
    3.2.2 结果与分析  26-32
      3.2.2.1 盐胁迫对角果木细胞中氧自由基代谢的影响  26-32
        3.2.2.1.1 盐胁迫对角果木根系总蛋白质含量的影响  26-27
        3.2.2.1.2 盐胁迫对角果木根系过氧化物酶(POD)活性的影响  27-28
        3.2.2.1.3 盐胁迫对角果木根系超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响  28-29
        3.2.2.1.4 角果木在盐胁迫下根系抗坏血酸(ASA)含量的变化  29
        3.2.2.1.5 角果木在盐胁迫下根系丙二醛(MDA)含量的变化  29-30
        3.2.2.1.6 角果木在盐胁迫下根系可溶性糖含量的变化  30-31
        3.2.2.1.7 角果木在盐胁迫下根系脯氨酸含量的变化  31-32
        3.2.2.1.8 盐胁迫对角果木根系多酚含量的影响  32
    3.2.3 讨论  32-34
      3.2.3.1 盐胁迫对角果木细胞中氧自由基代谢的影响  32-34
      3.2.3.2 盐胁迫对角果木根部渗透调节物质的影响  34
    3.2.4 结论  34-35
4 CDNA-AFLP法筛选角果木盐应答基因及表达分析  35-51
  4.1 实验材料  35-36
    4.1.1 植物材料  35
    4.1.2 菌株和质粒  35
    4.1.3 实验试剂  35-36
  4.2 实验方法和步骤  36-44
    4.2.1 提取红树总RNA  36-37
      4.2.1.1 CTAB法提取叶片的总RNA  36-37
      4.2.1.2 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶检测  37
    4.2.2 双链cDNA合成  37-38
    4.2.3 接头和引物的合成  38-39
    4.2.4 cDNA-AFLP筛选差异基因  39-41
    4.2.5 cDNA-AFLP产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显影  41
      4.2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备  41
      4.2.5.2 凝胶电泳  41
      4.2.5.3 凝胶银染显色  41
    4.2.6 差异条带DNA回收和克隆  41-42
    4.2.7 第二轮PCR产物的连接  42
    4.2.8 大肠杆菌(E.coil DH5α)的转化  42-43
      4.2.8.1 大肠杆菌(E.coil DH5α)感受态制备  42
      4.2.8.2 转化大肠杆菌DH5α、及抗性筛选的过程  42-43
    4.2.9 差异表达基因片段的序列分析  43
    4.2.10 差异片段的RT-PCR验证分析  43
    4.2.11 半定量RT-PCR方法分析差异表达基因的表达谱  43-44
  4.3 结果与分析  44-48
    4.3.1 RNA提取结果  44
    4.3.2 差异表达基因筛选  44-45
    4.3.3 差异表达基因片段的序列分析  45-47
    4.3.4 差异表达基因的RT-PCR验证分析  47
    4.3.5 半定量RT-PCR方法分析差异表达基因的表达谱  47-48
  4.4 讨论  48-50
  4.5 结论  50-51
参考文献  51-57
缩写词(ABBREVIATION)  57-58
在读期间论文发表情况  58-59
致谢  59

盐胁迫下红树植物—角果木耐盐生理及分子基础研究

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