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基于分子生态学技术的环境微生物群落结构与功能的研究

作　者: 杨朝晖
导　师: 曾光明
学　校: 湖南大学
专　业: 环境科学与工程
关键词: 16S rRNA/rDNA 堆肥序批式生物膜反应器厌氧氨氧化分子生态学变性梯度凝胶电泳限制性片段长度多态性系统发育分析
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

微生物是废水处理、城市生活垃圾填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物,充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据;此外,污染环境的土著微生物也是污染自净的重要作用者,深入了解其存在状况可以为这些污染环境的原位或异地恢复提供有力的微生物学根据。但是,目前研究环境微生物群落的主要方法仍是基于培养和分离纯化的传统技术,已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。利用基于16S rRNA/rDNA序列分析的分了生态学技术,研究者可以在不对微生物进行分离培养的情况下对其进行研究,甚至还可以利用原位核酸杂交和原位PCR技术对特定环境中的微生物进行原位分析鉴定,并对微生物群落的结构和功能进行研究,结果快速、准确。本论文提出和改进了溶菌酶法、超声波破碎法和蛋白酶K—CTAB法等3种方法从环境样品（本论文中以复杂的堆肥为例）直接提取微生物DNA,细胞直接计数表明三种方法对细胞的破碎效率均达到了94%以上,分光光度法检测表明纯化后的DNA中腐殖酸浓度低于20ng/μl,A_260/280值为1.7～1.8,使用16S rDNA引物对27F/1495R和GC341F/907R进行PCR扩增,均得到了特异性很强的扩增产物,利用PCR产物进行的限制性片段长度多态性分析和变性梯度凝胶电泳分析都表明,3种方法提取的DNA中有一致的微生物遗传多样性,因而能够应用于环境微生物分子生态学研究。为了初步了解堆肥中的细菌群落及其动态变化情况,使用餐厨垃圾进行为期18天的小规模堆肥,高温阶段（温度高于50℃）共7天,最高温度达到65℃,使用蛋白酶K—CTAB法从偶数天和高温阶段堆肥样品中提取总DNA,并使用16SrDNA引物对GC341F/907R进行PCR-DGGE分析,结合统计分析、条带测序和系统发育分析对其中的细菌进行分子生态学研究。结果表明随温度升高,堆肥中细菌多样性下降,不同时期的优势菌群不同,高温阶段细菌种群以嗜热的芽孢杆菌属细菌为主。同时,采用自主设计的SBBR反应器处理氨氮浓度含量较高的垃圾填埋场渗滤液并对其细菌的群落结构和脱氮机理进行分析。在保持（32±0.4）℃的环境温度下,经过58d的驯化和33d的稳定,SBBR反应器的脱氮效率最高达到95%。实验结果表明,高频间歇式曝气方式在抑制了硝酸细菌的活性的同时也消除了亚硝酸盐浓度和pH大幅波动对亚硝酸细菌和厌氧氨氧化细菌活性的影响;在曝气阶段,溶解氧浓度被控制在1.2～1.4 mg.L^-1,亚硝酸细菌成为主体细菌,亚硝酸盐积累;在缺氧阶段,厌氧氨氧化细菌成为主体细菌,曝气阶段积累的亚硝酸盐与氨氮同时被去除。为了研究序批式生物膜反应器中脱氮细菌的群落结构、种群变化及主要生物脱氮途径情况,使用统计分析、16S rDNA克隆测序和系统发育分析对生物膜细菌进行分子生态学研究。结果表明,载体上形成了种群比较丰富、群落结构与功能比较稳定的生物膜,其中包括好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌、大量的硝化细菌和厌氧反硝化细菌;在运行过程中的不同周期和单个周期的不同时刻,细菌群落组成都没有发生明显的变化;驯化的生物膜中的细菌可能主要来自于渗滤液,而用于接种的常规污水处理厂污泥对脱氮生物膜的形成贡献可能并不大。亚硝化-厌氧氨氧化-反硝化途径是反应器主要的脱氮途径,通过该途径去除的NH₄⁺-N占总去除量的65%以上;另外2条途径则分别是亚硝化-反硝化途径以及全程硝化-反硝化途径。所有途径都采取同步和分步2种方式完成,同步方式以曝气阶段的氮素亏损形式予以表现。分步方式则依靠各种脱氮微生物在曝气阶段和厌氧阶段不同的活性程度完成。另外,为进一步控制反应器运行成本,在3种不同的低温驯化策略下启动3套规格相同的厌氧序批式生物膜反应器（ASBBR）,在对运行过程中氮素变化规律进行分析的同时,利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术对生物膜上的细菌种群结构进行分析,初步考察了厌氧氨氧化的活性.结果表明,对应a1、a2和a3 3种不同的低温驯化策略,A1、A2和A33个反应器分别经过62、56、70d的驯化后表现出不同的厌氧氨氧化活性。以氮素转化效率作为衡量标准,其活性依次为A3＞A1＞A2。DGGE分析进一步说明在不同的驯化策略下,反应器表现出不同的种群多样性,但种群结构基本保持一致;在接种物相同的策略中,降温幅度对种群多样性的影响与其对厌氧氨氧化活性的影响具有一致性。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
插图索引  13-15
附表索引  15-16
第1章绪论  16-47
  1.1 环境微生物学及研究发展历程  16-17
    1.1.1 环境微生物的定义  16
    1.1.2 传统环境微生物研究方法的局限  16-17
    1.1.3 环境微生物研究的新发展  17
  1.2 分子生态学技术在环境微生物研究中的应用现状  17-47
    1.2.1 分子生物学概述  17-20
    1.2.2 16S rRNA/rDNA序列分析技术在环境微生物研究中的应用现状  20-47
第2章 DNA提取与纯化技术研究  47-62
  2.1.1 材料  47-48
  2.1.2 实验方法  48-55
  2.2 结果与讨论  55-60
    2.2.1 细胞裂解效率  55-56
    2.2.2 腐殖酸类物质含量  56-57
    2.2.3 提取周期及 DNA回收效率  57
    2.2.4 DNA产量和纯度  57-59
    2.2.5 RFLP分析  59-60
    2.2.6 DGGE分析  60
  2.3 结论  60-62
第3章 16S rRNA/rDNA序列分析技术研究堆肥微生物群落结构  62-80
  3.1 材料与方法  62-69
    3.1.1 材料  62-63
    3.1.2 实验方法  63-69
  3.2 结果与讨论  69-79
    3.2.1 堆肥化过程中的参数变化  69-70
    3.2.2 堆肥样品基因组总 DNA的提取与 PCR扩增  70-72
    3.2.3 PCR扩增  72
    3.2.4 DGGE指纹图谱结果与 Cs值分析  72-77
    3.2.5 嗜热细菌系统发育分析  77-79
  3.3 结论  79-80
第4章 SBBR处理垃圾渗滤液及其细菌群落动态变化的研究  80-112
  4.1 序批式生物膜技术概述  81-88
    4.1.1 技术背景及原理  82-83
    4.1.2 SBBR运行方式及特点  83-84
    4.1.3 SBBR工艺的应用研究  84-86
    4.1.4 SBBR工艺设计特点  86-88
    4.1.5 存在的问题  88
  4.2 脱氮途径简介  88-89
    4.2.1 全程硝化-反硝化途径  88-89
    4.2.2 短程硝化-反硝化途径  89
    4.2.3 短程硝化-厌氧氨氧化-反硝化途径  89
  4.3 材料与方法  89-97
    4.3.1 实验材料  89-94
    4.3.2 实验方法  94-97
  4.4 结果与讨论  97-111
    4.4.1 各形态氮素浓度的周期变化规律  97-98
    4.4.2 pH值的周期变化  98
    4.4.3 氨氮的逸散性  98-99
    4.4.4 反应期各阶段各形态氮素变化量分析  99-100
    4.4.5 主要脱氮机理分析  100-104
    4.4.6 DNA提取与纯化以及PCR扩增  104-105
    4.4.7 DGGE图谱的细菌多样性统计分析  105-107
    4.4.8 细菌系统发育分析  107-111
  4.5 结论  111-112
第5章不同低温驯化策略下的厌氧氨氧化活性  112-120
  5.1 实验材料与方法  112-114
    5.1.1 实验用水及装置  112-113
    5.1.2 实验方法  113
    5.1.3 分析项目与测试方法  113-114
  5.2 结果与讨论  114-119
    5.2.1 三种低温驯化策略下的驯化效果  114-116
    5.2.2 厌氧氨氧化活性  116-118
    5.2.3 生物膜 DGGE分析  118-119
  5.3 小结  119-120
结论  120-123
参考文献  123-137
致谢  137-138
附录 A(攻读学位期间发表的论文目录)  138-141
附录 B(攻读学位期间发表的著作目录)  141-142
附录 C(攻读学位期间主持与参加的研究课题)  142-143
附录 D(攻读学位期间获得的科技奖励)  143-144
附录 E(攻读学位期间申请及获授权的发明专利)  144-145

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