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珠三角水产养殖水体宏基因组文库的构建几丁质酶基因的筛选、分析

作　者: 李会琴
导　师: 林炜铁
学　校: 华南理工大学
专　业: 微生物学
关键词: Fosmid文库养殖水几丁质酶克隆文库变性梯度凝胶电泳
分类号: S917
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

对虾养殖是我国水产养殖的支柱产业之一。随着对虾养殖规模的不断扩大,对虾养殖污染问题日益严重。对虾残体在养殖环境中的堆积是污染原因之一,而对虾残体的主要成分为几丁质。因此有关几丁质酶的研究对于治理对虾养殖污染意义重大。本文首先分别用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和克隆文库技术研究了珠三角地区对虾养殖水体几丁质降解菌群的群落结构。在此基础上构建了对虾养殖水体宏基因组Fosmid文库,初步获取了对虾养殖水体的微生物遗传信息,最终使用功能筛选的方法从该文库中筛选到4个几丁质阳性克隆,对它们进行了基因序列测定以及一些酶学功能的研究。对于从虾池原位环境鉴定并筛选具有潜在益生作用的功能微生物,意义重大。主要结果如下:a.将变性梯度凝胶电泳技术应用于不同养殖时期对虾养殖水体几丁质降解菌群的研究,指纹图谱分析显示:养殖中期对虾养殖水体几丁质降解菌群多样性较后期丰富。b.构建第18家族几丁质酶基因克隆文库,研究对虾养殖水体中几丁质降解菌群的群落组成,结果表明:对虾养殖水体的几丁质降解菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)和一些未培养菌,分别占45%和40%。此外还包括:堆囊粘细菌属(Sorangium cellulosum)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、链霉菌属(Streptomyces roseosporus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)种类较丰富。并且其未培养几丁质降解菌均为放线菌类。c.采用低熔点琼脂糖包埋法提取宏基因组DNA,在此基础上构建了对虾养殖水体的宏基因组Fosmid文库,文库共获得克隆8000个,插入片断平均为35kb (25～58Kb),所建文库容量为280Mb。在连续传代100次时,文库仍保持很好的稳定性。d.用胶体几丁质筛选平板从8000个克隆子筛选到了4个阳性克隆子,分别命名为CF1、CF2、CF3、CF4。CF1与一株具有还原硝酸盐特性的蜡状芽孢杆菌序列同源性较高达94%。CF2序列同源性较高的微生物均为未培养的产几丁质酶微生物,且其基因序列中存在第18家族催化保守片段。CF3与Streptomyces ghanaensis ATCC 14672序列100%同源。e.对CF2克隆子的酶学特性进行初步研究,该酶最适PH为7.0,最适温度为35℃,在最适条件下其酶活达到了0.128U/ml,活性较高。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-24
  1.1 珠三角地区对虾养殖业的微生态制剂应用现况及面临的问题  12-14
    1.1.1 珠三角地区对虾养殖业的微生态制剂应用现况  12-13
    1.1.2 珠三角地区对虾养殖业的微生态制剂应用面临的问题  13-14
  1.2 宏基因组文库技术  14-18
    1.2.1 未培养微生物  14
    1.2.2 宏基因组技术起源  14-15
    1.2.3 宏基因文库分类  15
    1.2.4 构建宏基因组文库的策略  15
    1.2.5 宏基因组DNA 的提取与纯化  15-17
    1.2.6 宏基因组文库的筛选  17-18
  1.3 水体宏基因组学的研究现状  18-20
    1.3.1 水体的微生态监测  18-19
    1.3.2 新型基因、代谢途径的发现  19
    1.3.3 污染治理  19-20
  1.4 几丁质以及几丁质酶  20-23
    1.4.1 几丁质  20-21
    1.4.2 几丁质酶  21-23
  1.5 本研究的目的及内容  23-24
    1.5.1 本研究的目的  23
    1.5.2 本研究的内容  23-24
第二章养殖水体几丁质降解菌群的DGGE 分析  24-36
  引言  24
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 试验材料  24
    2.1.2 主要试剂和仪器  24-25
    2.1.3 基本溶液的配置  25-26
  2.2 方法  26-29
    2.2.1 基因组DNA 的提取  26-27
    2.2.2 NaAC 无水乙醇沉淀DNA  27
    2.2.3 几丁质酶基因PCR 的扩增  27-28
    2.2.4 几丁质降解菌的DGGE 分离  28
    2.2.5 几丁质降解菌群群落多样性统计学分析  28-29
  2.3 结果与分析  29-35
    2.3.1 养殖水体总DNA 的提取  29
    2.3.2 几丁质酶基因的PCR 优化  29-32
    2.3.3 DGGE 指纹图谱的分析  32-33
    2.3.4 不同养殖时期水样几丁质降解菌群的遗传多样性  33
    2.3.5 不同养殖时期水样几丁质降解菌群的群落相似性  33-35
  2.4 本章小结  35-36
第三章养殖水体几丁质酶基因文库的构建  36-47
  引言  36
  3.1 材料  36-37
    3.1.1 试验材料  36
    3.1.2 主要试剂和仪器  36-37
    3.1.3 相关溶液的配制  37
  3.2 方法  37-40
    3.2.1 养殖水样品基因组DNA 的提取  37
    3.2.2 几丁质酶基因片段的扩增  37-38
    3.2.3 几丁质酶基因文库的构建  38-39
    3.2.4 重组子筛选与鉴定  39-40
    3.2.5 几丁质酶基因序列分析  40
  3.3 结果与分析  40-46
    3.3.1 阳性质粒检测鉴定  40-41
    3.3.2 质粒酶切图谱  41-42
    3.3.3 测序结果分析  42-46
  3.4 本章小结  46-47
第四章典型养殖水体宏基因组技术平台的建立  47-60
  引言  47
  4.1 材料  47-51
    4.1.1 样品的采集与预处理  47
    4.1.2 主要试剂和仪器  47-48
    4.1.3 培养基及抗生素的配制  48-49
    4.1.4 常规溶液，缓冲液的配制  49
    4.1.5 载体与宿主菌的的保存  49-51
  4.2 实验方法  51-54
    4.2.1 宏基因组DNA 的提取  51
    4.2.2 宏基因组DNA 的回收与浓缩  51-52
    4.2.3 插入DNA 片断末端补平(end-repair reaction)  52
    4.2.4 宏基因组DNA 的连接转化  52-53
    4.2.5 CopycontrolTM Fosmid 克隆的包装  53-54
    4.2.6 CopycontrolTM Fosmid 文库的涂布  54
    4.2.7 CopycontrolTM Fosmid 文库的保存  54
    4.2.8 Fosmid 文库质量的鉴定  54
  4.3 结果与讨论  54-59
    4.3.1 养殖水体微生物菌体收集  55
    4.3.2 宏基因组DNA 的提取结果  55
    4.3.3 养殖水样中大片段目的DNA 的分离筛选  55-56
    4.3.4 养殖水样中大片段目的DNA 的回收  56-57
    4.3.5 养殖水样中大片段目的插入DNA 末端补平和浓度控制  57
    4.3.6 Fosmid 文库的构建及评估  57-59
  4.4 本章小结  59-60
第五章 Fosmid 文库中几丁质酶基因的筛选与分析  60-69
  引言  60
  5.1 材料  60-61
    5.1.1 样品来源  60
    5.1.2 主要试剂  60-61
  5.2 方法  61-63
    5.2.1 几丁质酶的筛选方法  61
    5.2.2 Fosmid 阳性克隆的培养、验证和测序  61-62
    5.2.3 几丁质酶基因的序列分析  62
    5.2.4 几丁质酶活性的测定  62-63
  5.3 结果与分析  63-68
    5.3.1 文库的几丁质酶活力分析  63
    5.3.2 阳性克隆子的验证  63-64
    5.3.3 几丁质酶基因序列分析  64-66
    5.3.4 克隆CF2 酶学活性的初步研究  66-68
  5.4 本章小结  68-69
结论与展望  69-71
  创新点  69
  主要结论  69-70
  展望  70-71
参考文献  71-78
攻读硕士学位期间取得的研究成果  78-79
致谢  79-80
附件  80

珠三角水产养殖水体宏基因组文库的构建几丁质酶基因的筛选、分析

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