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新城疫病毒F和HN囊膜蛋白对其致病力影响的研究

作　者: 王永
导　师: 李云章；步志高
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 新城疫病毒 LaSota疫苗株融合蛋白血凝素-神经氨酸酶蛋白反向遗传嵌合病毒重组病毒毒力 Mukteswar
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease. ND)是高度传染并造成重大经济损失的禽类疾病,其病原体是新城疫病毒(Newcastle disease virus NDV)。NDV是副黏病毒科的一员,被划归于禽副粘病毒属(Avulavirus)。不同毒力NDV毒株F蛋白裂解位点的氨基酸序列不同。低毒力株F蛋白都是单碱基裂解位点,即112(G/E)(K/R)Q(G/E)RL117,只能被有限组织中的细胞外蛋白酶裂解;而中等毒力株与强毒力株F蛋白的裂解位点是多碱基的,即112(R/K)RQ(R/K)RF117,可以被普遍存在的细胞内蛋白酶裂解。F蛋白的裂解效率被认为是影响NDV毒力的重要因素。因此,一直以来F蛋白的裂解位点都被认为是决定NDV病毒毒力的主要因素。NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白。它具有受体识别和神经氨基酶活性功能。但对其在致病性方面的作用却不为人知。一些研究认为副黏病毒F和HN蛋白之间病毒株型特异性的相互作用是细胞融合所必需的。负链RNA病毒反向遗传技术(Reverse genetics technology),即利用与病毒RNA相对应的cDNA在适当细胞内合成具有感染性的负链RNA病毒的方法,是90年代后期出现的新型病毒学技术。本研究就是在建立了NDV反向遗传操作系统(reverse genetic system)的基础上,分别通过F蛋白裂解位点突变、不同毒株F基因替换和HN基因替换以及不同外源基因的插入来研究这些因素对NDV毒力的影响。1、F蛋白碱裂解位点突变对重组新城疫rLaSota病毒致病力的影响在成功构建并拯救重组新城疫病毒LaSota株(rLaSota)的基础上,分别设计突变引物将rLaSota F蛋白裂解位点的氨基酸序列由112G-R-Q-G-R↓L117分别突变为112R-R-Q-R-R↓F117和112R-R-Q-R-R↓L117,利用拯救rLaSota的辅助质粒pBSNP,pBSP和pBSL与突变株的全基因组质粒共转染BHK-21细胞,救获F蛋白裂解位点突变的重组病毒。并通过测定重组病毒的MDT、ICPI、IVPI等毒力指标来评估其毒力的变化。2、异源F基因替换对嵌合新城疫LaSota病毒致病性的影响通过对F蛋白裂解位点突变的研究表明,NDV的毒力不仅仅是由F蛋白裂解位点的氨基酸序列决定的,NDV F蛋白除裂解位点氨基酸序列之外的其它部分也影响NDV的毒力。因此,分别用中等毒力疫苗株Mukteswar、经典强毒株F48E9和现地流行强毒株HB38的F基因替换rLaSota的F基因,利用反向遗传技术拯救F基因替换的重组病毒。通过测定重组病毒的MDT、ICPI、IVPI等毒力指标来评估其毒力的变化,2、异源HN基因替换对嵌合新城疫LaSota病毒致病性的影响在研究F蛋白裂解位点突变和不同毒力毒株的F基因替换rLaSota F基因对重组病毒毒力影响的基础上,我们发现NDV的毒力并非由F蛋白唯一决定,因此进一步用中等毒力株Mukteswar的HN基因替换rLaSota的HN基因,以研究HN基因对病毒毒力的影响,不同型毒株F和HN基因之间的相互作用,以及F蛋白裂解位点突变或不突变时,HN基因替换对重组病毒毒力影响。4、不同外源基因的插入对重组新城疫病毒毒力的影响在成功建立NDV LaSota株反向遗传操作系统的基础上,可以根据负链RNA病毒的特点来研究病毒的生物学特性与病原性,为此我们根据NDV的基因特征在其基因组的P基因与M基因之间分别插入增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)基因、传染性法氏囊病毒VP2基因(IBDV-VP2)和H5亚型高致病力禽流感病毒血凝素(AIV-HA)基因,并拯救重组病毒,用以研究不同性质外源基因插入对重组病毒毒力的影响。结果表明,F蛋白裂解位点的氨基酸序列可以显著影响病毒的毒力,特别是F蛋白117位氨基酸残基是病毒毒力的一个重要标记,它与之前的五个氨基酸残基之间存在某种相互作用以维持裂解位点的稳定性,同时表明NDV的毒力不仅仅是由F蛋白裂解位点的氨基酸序列决定的。HN基因可以影响病毒的毒力,但本研究结果与Huang等的结果不同,用中等毒力株Mukteswar的HN基因替换rLaSota的HN基因后,重组病毒的毒力有所下降,这表明NDV的毒力是多基因作用的结果,而且似乎与病毒的全基因组有关。外源基因的插入,可以影响病毒的复制与生长,显著降低重组病毒的毒力,但是不同性质的外源基因对重组病毒毒力的影响不同。可以包装到重组病毒囊膜表面的外源糖蛋白对病毒毒力的影响最为显著。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
1前言  13-35
  1.1 新城疫的历史  13-14
  1.2 新城疫病毒  14-18
  1.3 新城疫病毒的生物学特性  18-20
    1.3.1 血凝性  18
    1.3.2 神经氨酸酶活性  18
    1.3.3 细胞融合与溶血  18
    1.3.4 培养  18-19
    1.3.5 抗肿瘤作用  19
    1.3.6 病原性  19-20
  1.4 负链RNA 病毒反向遗传技术回顾  20-30
    1.4.1 负链RNA 病毒简介  20-22
    1.4.2 反向遗传技术的发展及感染性病毒的拯救  22-25
    1.4.3 反向遗传技术的应用  25-30
  1.5 目前对影响NDV 毒力因素的研究  30-35
    1.5.1 对NDV 融合蛋白（ F ）的研究  30-32
    1.5.2 对NDV 血凝素－神经氨酸酶蛋白（HN）的研究  32-33
    1.5.3 对NDV V 蛋白的研究  33
    1.5.4 外源基因对重组NDV 毒力的影响  33-35
2 实验一 F 蛋白碱裂解位点突变对重组新城疫LaSota 病毒致病力的影响  35-46
  2.1 材料与方法  35-40
    2.1.1 细胞和病毒  35
    2.1.2 SPF 鸡和SPF 鸡胚  35-36
    2.1.3 主要试剂和仪器  36
    2.1.4 引物设计与合成  36
    2.1.5 目的片段的PCR、克隆与测序及全长基因组的构建  36-37
    2.1.6 病毒拯救  37-38
    2.1.7 重组病毒的RT-PCR 与序列确认  38
    2.1.8 各重组病毒的致病性试验  38-39
    2.1.9 重组病毒rL-F(M)-L 的F 蛋白裂解位点氨基酸序列遗传稳定性的研究  39-40
    2.1.10 各重组病毒的鸡胚生长特性  40
    2.1.11 重组病毒免疫原性检测  40
  2.2 结果  40-44
    2.2.1 重组病毒的拯救  40-41
    2.2.2 重组病毒的生长特性  41
    2.2.3 重组病毒的致病性  41-43
    2.2.4 重组病毒r L - F ( M) - L 的F 蛋白裂解位点氨基酸序列遗传稳定性  43
    2.2.5 重组病毒rLaSota、L-F(M)-F、rL-F(M)-L 的免疫原性及其对强毒攻击免疫保护效果  43-44
  2.3 讨论与小结  44-46
3 实验二异源F 基因替换对嵌合新城疫L a S o t a 病毒致病性的影响  46-54
  3.1 材料与方法  46-50
    3.1.1 细胞和病毒  46
    3.1.2 S P F 鸡和S P F 鸡胚  46
    3.1.3 主要试剂和仪器  46-47
    3.1.4 引物设计与合成  47
    3.1.5 病毒RNA的提取、反转录和PCR  47
    3.1.6 r L a S o t a F 基因替换全长基因组cDNA的构建  47-48
    3.1.7 嵌合病毒的拯救  48
    3.1.8 嵌合病毒的RT-PCR 与序列分析鉴定  48-49
    3.1.9 嵌合病毒在S P F 鸡胚的生长特性  49
    3.1.10 嵌合病毒致病力指标测定  49-50
  3.2 结果  50-52
    3.2.1 从全长cDNA克隆拯救嵌合型NDV  50
    3.2.2 嵌合病毒在S P F 鸡胚的生长特性  50-51
    3.2.3 嵌合病毒致病力指标测定  51-52
  3.3 讨论与小结  52-54
4 实验三异源HN 基因替换对嵌合新城疫L a S o t a 病毒致病性的影响  54-67
  4.1 材料与方法  55-60
    4.1.1 细胞和病毒  55
    4.1.2 S P F 鸡和SPF 鸡胚  55
    4.1.3 主要试剂和仪器  55
    4.1.4 引物设计与合成  55-56
    4.1.5 HN 基因替换全长基因组cDNA 的构建  56-57
    4.1.6 嵌合病毒的拯救  57
    4.1.7 嵌合病毒的RT-PCR 与序列分析鉴定  57-58
    4.1.8 嵌合病毒在S P F 鸡胚的生长特性  58
    4.1.9 红细胞吸附试验  58-59
    4.1.10 HN 蛋白对F 蛋白细胞融合能力的影响  59
    4.1.11 嵌合病毒致病力指标测定  59-60
  4.2 结果  60-65
    4.2.1 从全长cDNA 克隆拯救嵌合型NDV  60
    4.2.2 嵌合病毒在S P F 鸡胚的生长特性  60
    4.2.3 红细胞吸附（HAd）能力及细胞融合活性  60-63
    4.2.4 嵌合病毒的细胞致病性  63-64
    4.2.5 嵌合病毒的体内致病性  64-65
  4.3 讨论与小结  65-67
5 实验四不同外源基因的插入对重组新城疫病毒毒力的影响  67-79
  5.1 材料与方法  68-74
    5.1.1 细胞和病毒  68
    5.1.2 S P F 鸡和SPF 鸡胚  68
    5.1.3 主要试剂和仪器  68
    5.1.4 引物设计与合成  68-69
    5.1.5 A IV 病毒RNA 的提取、反转录和PCR  69
    5.1.6 表达不同外源基因NDV F突变株全长基因组cDNA的构建  69-72
    5.1.7 插入外源基因重组病毒的拯救  72
    5.1.8 各重组病毒的RT-PCR 与序列分析鉴定  72
    5.1.9 重组病毒引起寄主细胞融合的差别  72-73
    5.1.10 各重组病毒的致病性试验  73
    5.1.11 各重组病毒的鸡胚生长特性  73-74
  5.2 结果  74-77
    5.2.1 重组病毒的拯救  74
    5.2.2 各重组病毒对鸡胚、雏鸡致病性的测定  74-75
    5.2.3 重组病毒引起寄主细胞融合的差别  75-76
    5.2.4 重组病毒的生长特性  76-77
  5.3 讨论与小结  77-79
6 全文总结  79-81
参考文献  81-97
附录  97-138
致谢  138-139
作者简介  139

新城疫病毒F和HN囊膜蛋白对其致病力影响的研究

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