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Ri质粒对茶树和苦瓜的遗传转化及相关功能成分研究

作　者: 毛清黎
导　师: 施兆鹏；李玲；刘仲华
学　校: 湖南农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树 苦瓜 Ri质粒 儿茶素 苦瓜皂甙 发根农杆菌 功能成分
分类号: S642.5
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 212次
引　用: 2次
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内容摘要


发根农杆菌（Agrobactorium rhizogenes，Ar）中Ri质粒（根诱导质粒，root inducing plasmid）的T-DNA转移并整合到植物基因组诱导产生发根（hairy root）。相对于常规细胞培养，发根培养系统具有生长快速，不需外源植物激素、遗传性状稳定以及合成次生代谢物质能力强等特点，是生产次生代谢产物较理想的细胞培养体系。国内外医药学方面的大量研究证明：茶叶中的儿茶素（特别是酯型儿茶素）和苦瓜中的苦瓜皂甙等次生代谢产物具有明显的保健及药理功能。近年来，利用发根培养体系生物合成植物有效成分已成为植物医药研究热点。由于茶树是多年生富含多酚的木本植物，Ri质粒介导的遗传转化有相当的难度，诱导发根形成的成功率低。因此，目前国内外还没建立较完整稳定的Ri质粒转化茶树及其发根培养生产次生代谢物的技术体系；而利用Ri质粒转化苦瓜产生发根以及利用苦瓜发根培养系统生物合成苦瓜皂甙等功能成分的研究在国内外仍是空白。本文对发根农杆菌致根活力鉴定方法、儿茶素对发根农杆菌的抑制作用及抗酚菌株的筛选、苦瓜皂甙快速测定方法和Ri质粒高频诱导茶及苦瓜发根形成的影响因素进行了系统研究，并对茶及苦瓜发根中的相关功能成分进行了初步分析探讨。本文的主要研究结果如下：1．发根农杆菌具有完整质粒和活力菌株（R1601）的Km抗性培养菌落特征为涂板培养菌落应较均匀布满整个平板，而划线培养则在划线处均应有菌落生长。2．儿茶素（TC80）对发根农杆菌有明显的抑制作用，液体培养时MIC90为25μg／ml；而固体培养时的MIC90为100-200μg／ml，无论是液体还是固体培养，其MBC（最小杀菌浓度）为400μg／ml，这阐明了茶树中富含儿茶素等多酚类是制约农杆菌介导法对茶树进行遗传转化的关键因子。3．通过抗酚筛选获得的抗酚菌株R1000AP，其抗酚性与原始菌株R1000相比明显提高，其MIC90提高近40倍。抗酚菌株（R1000AP）诱导茶树的发根频率比原非抗酚菌株（R1000）提高46.5％，并达显著差异（P＜0.05）。4．综合分析茶树发根高频诱导影响因素认为：选用抗酚菌株、以含多酚类较低的原料（如绿茶品种）及器官（根或茎）作外植体、采用对外植体细胞壁造成微创的预处理（如萎凋或适度超声）、菌液浓度为OD600=0.8、浸染时间为30min以及共培养添加适当的激素（如IBA5.0mg／L）和共培养时间控制在2d以内，这样的因素水平即构成了Ri质粒对茶树遗传转化的高频诱导系统。5．由R1000AP菌株诱导形成的发根含有较丰富的儿茶素，其总量高达15.061mg／g，比福鼎大白茶一芽二叶鲜叶原料中的儿茶素总量12.086mg／g还高出近25％，且有近11％的酯型儿茶素的形成。6．本文建立的苦瓜中苦瓜总皂甙超声波乙醇浸提快速测定方法仅需样品0.1g，浸提溶剂80％乙醇2ml，浸提时间仅需30min，不需加热，降低能耗，分析测定效率提高十倍以上。测定结果与常规的乙醇加热回流没有显著差异。7．本文对影响Ri质粒高频诱导苦瓜遗传转化因素进行了较系统研究。5种供试菌株中R1000AP诱导发根的效果最全面，不仅发根早，且发根频率和发根密度都最高；苦瓜品种间的遗传转化率没有显著差异（P＞0.05）；茎段比子叶外植体平均高26.3％，这种差异达极显著水平（P＜0.01）；较嫩的苦瓜苗（苗龄10-20d）对发根农杆菌较敏感，有利于遗传转化，而苗龄超过40d苦瓜转化率几乎为零。共培养的适宜时间为1-d时，超过2d的处理，因农杆菌在诱导培养过程中过度生长，而使遗传转化效果下降。共培养基中添加AS对苦瓜的遗传转化没有明显的效果（P＞0.05）。植物激素处理均可使发根形成时间提前5d，并最终提高发根诱导频率，其中IBM5.0诱导苦瓜遗传转化的效果最好。8．不同外植体诱导形成的发根的形态特征有一定的差异，茎段发根粗短绒毛多，长度多在10-25mm，发根密度为9.0；而子叶发根较粗长，绒毛较少，根长度多在40-50mm，发根密度为11.25。茎段发根的生长速度约为2-5mm／d，而子叶发根的生长速度约为8-10mm／d。9．用超声醇提—香草醛显色法对试管苗的根、茎、子叶和发根中苦瓜总皂甙进行了比较分析结果表明：发根中苦瓜总皂甙含量最高，分别比苦瓜试管苗的根、茎和子叶含量高68.9％、53.6％和54.7％，且这种差异达到了极显著水平（P＜0.001）。以上研究结果为Ri质粒介导的茶及苦瓜发根高频诱导与遗传转化系统的建立以及利用该发根培养系统生物合成儿茶素和苦瓜皂甙等功能成分提供了重要科学依据和方法。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词表  10-18
上篇  18-96
  第一章 绪论  19-55
    1 Ri质粒对植物遗传转化的研究进展  19-27
      1.1 发根农杆菌及其Ri质粒的特性  19-23
        1.1.1 发根农杆菌的特性  19-20
        1.1.2 Ri质粒的分类  20
        1.1.3 Ri质粒的结构与功能  20-22
        1.1.4 rol基因的位点与特征  22-23
        1.1.5 发根农杆菌的侵染和致病过程  23
      1.2 发根及其转化和鉴定  23-24
        1.2.1 发根的特点  23
        1.2.2 发根的转化与鉴定  23-24
      1.3 影响发根农杆菌对植物遗传转化效率的因素  24-26
        1.3.1 不同菌株属性农杆菌对转化的影响  24
        1.3.2 植物基因型及外植体对转化的影响  24-25
        1.3.3 化学因子对转化的影响  25
        1.3.4 物理因子对转化的影响  25-26
      1.4 Ri质粒对植物遗传转化在植物次生代谢产物生产中的应用现状  26-27
    2 国内外茶叶相关研究进展  27-43
      2.1 茶叶儿茶素保健功能研究  27-39
        2.1.1 抗癌、抗氧、抗衰作用  28-31
          2.1.1.1 抗癌作用  28-29
          2.1.1.2 抗氧化作用  29-30
          2.1.1.3 抗衰老作用  30-31
        2.1.2 降脂、降糖、降压及减肥作用  31-33
          2.1.2.1 降脂作用  31
          2.1.2.2 降糖作用  31-32
          2.1.2.3 降压作用  32
          2.1.2.4 减肥作用  32-33
        2.1.3 抑菌、消炎和除臭作用  33-37
          2.1.3.1 抑菌作用  33-34
          2.1.3.2 消炎作用  34-36
          2.1.3.3 除臭作用  36-37
        2.1.4 对神经损伤性疾病的防治作  37-39
          2.1.4.1 预防阿耳茨海默(氏)病的作用  37-38
          2.1.4.2 预防帕金森(氏)痴呆症的作用  38-39
      2.2 茶树离体培养儿茶素生物合成研究  39-41
        2.2.1 茶树离体培养对儿茶素组成的影响  39
        2.2.2 茶树离体培养中培养基组成对儿茶素生物合成的影响  39-40
        2.2.3 茶树离体培养中茶树品种对儿茶素生物合成的影响  40
        2.2.4 茶树离体培养中前体物对儿茶素生物合成的影响  40
        2.2.5 茶树离体培养中培养方法对儿茶素生物合成的影响  40-41
      2.3 农杆菌对茶树遗传转化研究  41-43
    3 本研究的目的与意义  43-45
    4 本研究的主要内容  45-46
    参考文献  46-55
  第二章 发根农杆菌菌株特性及其活力鉴定研究  55-68
    1 引言  55
    2 材料与方法  55-59
      2.1 实验材料  55-57
        2.1.1 供试菌株  55-56
        2.1.2 培养基  56
        2.1.3 试剂  56-57
      2.2 实验方法  57-59
        2.2.1 Km抗性筛选和菌液生长曲线及菌落特征  57
        2.2.2 生化检测(3-酮乳糖产物法)  57
        2.2.3 PCR鉴定  57-59
        2.2.5 绘图  59
    3 结果与分析  59-64
      3.1 Km抗性培养的菌液生长曲线及菌落特征  59-61
      3.2 发根农杆菌菌株活力的生化测定  61
      3.3 发根农杆菌菌株活力的生物测定  61-62
      3.4 发根农杆菌菌株的PCR鉴定  62
      3.5 不同抗菌素对发根农杆菌的抑制效果  62-64
    4 讨论  64-66
    5 本章小结  66-67
    参考文献  67-68
  第三章 茶多酚对发根农杆菌的抑制作用及抗酚菌株的筛选  68-78
    1 引言  68
    2 材料与方法  68-70
      2.1 实验材料  68-69
        2.1.1 菌株  68
        2.1.2 AB培养基  68
        2.1.3 儿茶素  68-69
        2.1.4 外植体及试管苗原料  69
      2.2 实验方法  69-70
        2.2.1 试管苗培养  69
        2.2.2 菌种的活化  69
        2.2.3 儿茶素对发根农杆菌抑制的液体培养实验  69
        2.2.4 儿茶素对发根农杆菌抑制的固体培养实验  69
        2.2.5 外植体的转化  69-70
        2.2.6 绘图及统计  70
    3 结果与分析  70-74
      3.1 儿茶素对发根农杆菌的抑制作用  70-71
      3.2 发根农杆菌抗茶多酚菌株的筛选及其抗酚性实验  71
      3.3 抗酚菌株与非抗酚菌株对茶树遗传转化效果比较  71-74
    4 讨论  74-75
    5 本章小结  75
    参考文献  75-78
  第四章 Ri质粒对茶树的遗传转化及儿茶素等功能成分的变化研究  78-96
    1 引言  78
    2 材料与方法  78-81
      2.1 实验材料  78-79
        2.1.1 植物材料  78-79
        2.1.2 供试发根农杆菌菌株  79
        2.1.3 培养基  79
      2.2 实验方法  79-81
        2.2.1 试管苗培养  79
        2.2.2 菌种的保存和活化  79-80
        2.2.3 外植体的转化  80
        2.2.4 外植体的特殊处理  80
        2.2.5 乙酰丁香酮处理  80
        2.2.6 Ri质粒对茶树遗传转化效果的多因素正交实验设计  80-81
        2.2.7 统计分析和作图  81
        2.2.8 组织鲜样中儿茶素和咖啡碱提取及样品制备  81
        2.2.9 儿茶素和咖啡碱含量的HPLC分析方法及条件  81
    3 结果与分析  81-91
      3.1 Ri质粒对茶树遗传转化效果的多因素正交实验  81-83
      3.2 发根农杆菌菌株及外植体种类对茶树发根诱导效率的影响  83-86
        3.2.1 发根农杆菌菌株种类对茶树发根诱导效率的影响  83-85
        3.2.2 外植体种类对茶树发根诱导效率的影响  85-86
      3.3 浸染因素对茶树发根诱导效率的影响  86-87
        3.3.1 菌液浓度对茶树发根诱导的影响  86-87
        3.3.2 浸染时间对茶树发根诱导的影响  87
      3.4 共培养因素对茶树发根诱导的影响  87-90
        3.4.1 共培养时间对茶树发根诱导的影响  87-88
        3.4.2 乙酰丁香酮(AS)对茶树发根诱导的影响  88-89
        3.4.3 植物生长调节剂对茶树发根诱导的影响  89-90
      3.5 茶树发根中儿茶素及咖啡因含量的变化  90-91
    4 讨论  91-93
    5 本章小结  93-94
    参考文献  94-96
下篇  96-138
  第一章 绪论  96-111
    1 苦瓜的有效成分研究  96-99
      1.1 三萜类皂甙  96-98
      1.2 甾体类皂甙  98
      1.3 蛋白质、多肽及氨基酸类  98-99
      1.4 其他化合物  99
    2 苦瓜的药理功能研究  99-103
      2.1 降血糖作用  99-101
      2.2 抗衰老作用  101-102
      2.3 抗肿瘤作用  102
      2.4 抗病毒和抗艾滋病作用  102-103
      2.5 其它作用  103
    3 苦瓜皂甙分离纯化技术研究  103-105
      3.1 醇提工艺的优化研究  103-104
      3.2 超声波辅助技术应用  104
      3.3 微波辅助技术应用  104-105
      3.4 酶提辅助技术应用  105
    4 苦瓜皂甙的分析测定方法研究  105
      4.1 高效液相色谱法  105
      4.2 高效薄层色谱法  105
      4.3 分光光度法  105
    5 本研究的目的与意义  105-107
    6 本研究的主要内容  107-108
    参考文献  108-111
  第二章 超声乙醇浸提快速测定苦瓜总皂甙的方法研究  111-120
    1 引言  111
    2 材料与方法  111-112
      2.1 实验材料  111
      2.2 实验方法  111-112
        2.2.1 苦瓜总皂甙的浸提  111-112
        2.2.2 测定波长的确定  112
        2.2.3 建立直线回归方程  112
        2.2.4 统计分析和作图  112
    3 结果与分析  112-116
      2.1 测定波长的确定  112
      2.2 建立直线回归方程  112
      2.3 显色稳定性考察结果  112-114
      2.4 样品量对超声醇提效果的影响  114-115
      2.5 超声醇提与常规热醇提效果比较  115
      2.6 超声醇提─香草醛显色法重复性实验结果  115-116
      2.7 超声醇提加标回收率实验结果  116
    4 讨论  116-117
    5 本章小结  117-118
    参考文献  118-120
  第三章 Ri质粒对苦瓜遗传转化及苦瓜皂甙含量变化研究  120-138
    1 引言  120
    2 材料与方法  120-122
      2.1 实验材料  120-121
        2.1.1 植物材料  120
        2.1.2 供试发根农杆菌菌株  120
        2.1.3 培养基  120-121
        2.1.4 化学试剂  121
      2.2 实验方法  121-122
        2.2.1 试管苗培养  121
        2.2.2 菌种的保存和活化  121
        2.2.3 外植体的转化  121-122
        2.2.4 苦瓜总皂甙测定  122
    3 结果与分析  122-132
      3.1 Ri质粒对苦瓜遗传转化效果的多因素正交实验  122-123
      3.2 菌株特性对苦瓜遗传转化效果的影响  123-125
        3.2.1 不同菌株对苦瓜遗传转化效果的影响  123-124
        3.2.2 发根农杆菌的生理状态及菌液浓度对苦瓜遗传转化效果的影响  124-125
      3.3 苦瓜外植体特征对苦瓜遗传转化效果的影响  125-127
        3.3.1 不同苦瓜品种对苦瓜遗传转化效果的影响  125-126
        3.3.2 不同苦瓜器官对苦瓜遗传转化效果的影响  126
        3.3.3 不同苦瓜苗龄对苦瓜遗传转化效果的影响  126-127
      3.4 浸染因素对苦瓜遗传转化效果的影响  127-128
        3.4.1 浸染时间对苦瓜遗传转化效果的影响  127-128
        3.4.2 菌种悬浮液种类对苦瓜遗传转化效果的影响  128
      3.5 共培养因素对苦瓜遗传转化效果的影响  128-131
        3.5.1 共培养时间对苦瓜遗传转化效果的影响  129
        3.5.2 乙酰丁香酮(AS)对苦瓜遗传转化效果的影响  129-130
        3.5.3 植物生长调节剂对苦瓜遗传转化效果的影响  130-131
      3.6 苦瓜发根形态特征及生长速度  131
      3.7 苦瓜发根中苦瓜皂甙含量  131-132
    4 讨论  132-134
    5 本章小结  134-135
    参考文献  135-138
全文总结  138-141
  1 主要研究结果  138-139
  2 主要创新之处  139-140
  3 展望  140-141
致谢  141-143
作者简介  143-144
在读期间科研学术成果  144-145

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