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禽呼肠孤病毒野毒株σC基因、抗原性及致病性比较研究

作　者: 王蕾
导　师: 崔治中
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽呼肠孤病毒(ARV) 致病性 σC基因抗原性核酸探针
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

呼肠孤病毒(reovirus)是呼吸道肠道孤儿病毒(respiratory enteric orphan virus)的简称,可分为两个主要的群,即哺乳动物来源呼肠孤病毒(MRV)和禽类来源呼肠孤病毒(ARV)。ARV属于呼肠孤病毒科中的正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus genus )。ARV可引起多种疾病,常见的有病毒性关节炎/腱鞘炎、吸收障碍综合征(MAS)、免疫抑制等。据报道ARV不同分离株的致病性差异很大,血清型多达10个以上。虽然ARV在我国鸡群中感染甚为普遍,但对ARV分离株的致病性和抗原性方面很少有系统的研究报道。为了阐明ARV感染对我国养鸡业的确切危害及其流行病学,本文对不同地区、表现不同临床症状的不同类型的鸡群分离到的ARV的抗原性关系、部分基因核酸序列和对鸡的致病性作了比较研究。1、10株ARV野毒株的分离、鉴定和纯化为了研究我国禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)流行毒株的致病性、抗原性及与抗原蛋白σC基因之间的关系,利用细胞培养方法从山东、北京、大连、新疆、吉林、江苏等不同省市患关节炎或(和)生长不良的鸡场分离到10株ARV。并以间接荧光抗体试验和RT-PCR扩增及序列分析的方法鉴定验证为禽呼肠孤病毒。其中7株来自患关节炎病鸡,分别为DL、DF、LC、CHX、NT、LY、XJ株;两株来自生长不良的肉鸡,为ZZ、CC株;一株来自关节炎和生长不良同时存在的种鸡,为YT株。上述病毒经CEF传代适应后,经无限稀释法连续纯化三次,以此纯化的病毒作为致病性和抗原性比较研究的病毒株。2、不同分离株ARVσC基因序列与抗原性比较据报道,σC蛋白是ARV的抗原性蛋白。在本研究中,设计一对引物,用RT-PCR法扩增CHX、LY、CC、DL、LC分离株中编码σC蛋白的S1基因片断,并克隆测序,结果显示,这些ARV分离株编码σC蛋白基因片段的同源性均在99%以上,其中CC、CHX和LY株的σC基因100%同源。用经纯化的ARV分离株分别用SPF鸡制备单因子血清,采用固定病毒稀释血清的方法在不同的毒株间进行血清中和反应,并计算相关系数r值。结果显示,ZZ、CC、CHX、LY、NT、XJ、S1133(疫苗株)的同源性均在25~74%之间,说明这些国内不同区域分离的ARV野毒株虽然仍属同一血清型,但抗原性已出现很大的差异。从ARV野毒株σC基因片断测序结果和病毒交叉中和试验结果比较表明,ARV血清中和反应的抗原性并非仅仅与σC蛋白有关,有可能存在其它结构蛋白与该病毒的免疫保护性有关。3、不同ARV株对SPF来航鸡致病性比较研究3.1不同ARV株对SPF来航鸡生长的影响为了研究ARV野毒株对SPF来航鸡的体增重的影响,用上述分离、纯化的ARV野毒株分别经皮下注射的途径感染1日龄SPF来航鸡,105TCID50/只,观察ARV感染对鸡体重的影响。结果显示,来自关节炎的CHX、NT、LY、XJ株感染1日龄SPF鸡后,在28、35、42、49日龄时,试验组与对照组相比,对体增重的影响差异不显著(P>0.05)。来自关节炎和生长不良肉种鸡的YT株对鸡的体重有显著影响,在28、35、42日龄时,感染组和对照组体重分别为219±28.8g vs. 249±21.6 g、301±29.3g vs. 343±47.8 g、371±39.7g vs. 424±45.2 g,差异均显著(P<0.05)。来自生长不良商品肉鸡的CC、ZZ株感染1日龄SPF鸡,也能诱发一定程度的生长迟缓。在45日龄时,感染CC、ZZ株组鸡体重平均值分别为481g±66.7g和488±55.1g,显著低于对照组533±62.6g(P<0.05)。3.2 ARV株感染与关节炎的关系用来自关节炎患鸡的8株ARV和来自生长迟缓的2株ARV分离株分别感染1日龄SPF鸡,在随后的6～9W的试验过程中,所有ARV分离株感染鸡均未出现典型的关节炎症状。3.3 ARV感染对免疫器官的影响来自关节炎的LY株和来自生长迟缓的ZZ、CC株ARV分别感染1日龄SPF鸡,30日龄时经对感染鸡法氏囊组织切片观察发现,ARV感染引起法氏囊淋巴滤泡萎缩,淋巴细胞减少,表明ARV感染可引起淋巴滤泡的损伤。但是从免疫器官指数看,并不是每一ARV感染组都能引起鸡免疫器官萎缩。6个ARV感染组,如DF、DL、LC、LY、ZZ株对SPF鸡的法氏囊指数、胸腺指数均未发现明显差异(P>0.05);但感染CC株的鸡30日龄时,法氏囊指数、胸腺指数分别为0.44±0.11、0.42±0.06,均明显低于对照组的0.55±0.14、0.54±0.09(P<0.05); ZZ株接种组仅胸腺指数略低于对照组,但差异不显著(P>0.05)。3.4 ARV感染对其它疫苗免疫后抗体反应的抑制作用分别用纯化的ARV野毒株经皮下注射的途径感染1日龄SPF来航鸡,105TCID50/只,7日龄时免疫禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)灭活疫苗,比较免疫后不同周龄时抗NDV、AIV的抗体滴度。结果表明,不同毒株对疫苗免疫后的抗体滴度影响差异比较大,在所有检测的分离株中,除ZZ株外,其余分离株对NDV、AIV抗体的影响呈现程度不一的一过性减低的作用。有的毒株对AIV和NDV都产生一过性影响(如DF株免后6W时抗NDV抗体、免后4W时抗AIV抗体,CC株3W时对AIV和NDV抗体反应的抑制作用);有的毒株仅对AIV抗体产生影响(如XJ株免后6W时、NT株在4W、6w时抗AIV抗体滴度的影响);有的毒株只是一过性影响NDV抗体反应(如LC株免疫后6W、LY株3W、CHX株4W时抗NDV抗体滴度显著低于对照组)。但ZZ株可显著减低NDV疫苗的抗体反应,在免疫后3、4、6W时,抗NDV抗体水平显著低于对照组,分别为4.3±2.22 vs. 6.2±3.55个Log2;4.2±1.12 vs. 5.8±1.97个Log2;4.7±0.95 vs. 5.9±1.17个Log2(P<0.05)。4、LY株ARV对IBDV强毒致病性和疫苗免疫后抗体反应的影响为进一步研究ARV的致病性及与其它病毒相互间的作用,本研究选用LY株ARV进行了进一步的研究。LY株ARV经皮下注射感染1日龄SPF来航鸡,105TCID50/只。结果显示,LY株感染对SPF鸡增重及7日龄AIV和NDV疫苗免疫后抗体滴度没有显著影响,但可引起法氏囊萎缩和淋巴细胞减少。LY株ARV感染1日龄SPF鸡后,30、52日龄时再分别用强毒株IBDV(GX株)攻击。结果显示,于30日龄攻击IBDV强毒后,1日龄感染LY株ARV的试验组死亡率为20.8%(5/24),显著低于未感染ARV仅攻击IBDV强毒对照组的58.3%(14/24);于52日龄时,攻击IBDV后,LY株ARV感染组死亡率为56.5%(13/23),仅攻击强毒IBDV的对照组为62.5%(15/24),差异已经不显著。这表明,随着日龄的增长,ARV感染引起的损伤有所恢复。ARV对强毒株IBDV的这种致病性减低的影响可能由于ARV感染导致IBDV的靶细胞受损,影响了IBDV的繁殖所致。用LY株ARV感染1日龄SPF鸡,经IBDV弱毒疫苗免疫后,诱发的抗体滴度为2303±1310,显著低于对照组的3288±1451(P<0.01);但对随后IBDV强毒株攻毒的保护率却与对照鸡无显著差异。经IBDV弱毒疫苗免疫后,产生的抗体足以保护强毒株IBDV攻击,不会引起死亡,但强毒攻击仍能显著抑制AIV、NDV疫苗免疫后的抗体滴度。然而,对于1～7日龄经ARV感染的鸡,IBDV强毒的这种免疫抑制作用又显著低于未经ARV感染的对照鸡,表明ARV感染可影响其他疾病的致病性。ARV感染与IBDV共感染的这种复杂性,极有可能是由于ARV感染对IBDV的靶细胞淋巴滤泡的损伤所致。5、ARV对肉鸡的致病性研究5.1 ARV感染对肉鸡生长的影响用上述分离、纯化的来自生长迟缓鸡的CC株、ZZ株经足垫+口服的途径感染1日龄商品肉鸡,105TCID50/只,观察ARV感染对肉鸡体重的影响。结果显示,ZZ、CC株感染组鸡19日龄时体重分别为591±73.7g,584±46.0g,明显低于对照组(682±74.3g),差异极显著(P<0.01)。在随后的26、56日龄称重时,所有试验组体重均低于对照组,除ZZ株足垫攻击组鸡26日龄时体重差异显著外(P<0.05),其余均差异极限著(P<0.01)。来自关节炎肉鸡的LY、XJ株感染组鸡21日龄时体重分别为655±67.7g、643±72.7g,显著低于对照组714±47.8g,差异极显著(P<0.01),但到37日龄时,感染组肉鸡体重有所恢复,LY、XJ株感染组分别为1397±131.2g、1485±188.6g,与对照组的1452±297.7g相比,已无显著差异(P>0.05)。ARV感染对肉鸡的体重影响结果表明,来自关节炎的LY、XJ株ARV对肉鸡体重只有一过性影响,没有像来自生长迟缓的CC、ZZ株那样明显抑制肉鸡的生长。5.2 ARV感染肉鸡对疫苗免疫后抗体反应的抑制作用用纯化的CC、ZZ、LY、XJ株感染1日龄商品肉鸡,105TCID50/只,于7日龄时免疫NDV灭活疫苗,考察ARV感染对NDV灭活疫苗抗体产生的影响。结果显示,ZZ株感染组3W时抗NDV抗体滴度为2.17±0.65 Log2,显著低于对照组2.8±0.71 Log2,差异极显著(P<0.01)。CC、LY、XJ株感染组的抗NDV抗体滴度尽管低于对照组,但差异不显著(P>0.05)。6、用地高辛标记的核酸探针检测ARV在鸡群中的传播用地高辛标记禽呼肠孤病毒(ARV)S1基因中编码σC蛋白的基因片段作为核酸探针,用以检测组织中的ARV。核酸探针的敏感性和特异性结果显示,该核酸探针特异性强,可检测到1.6 pg的探针DNA。利用所标记的核酸探针,检测了实验室感染CHX株ARV的鸡羽毛囊及体内不同组织病毒繁殖分布动态。结果显示,ARV感染1日龄SPF鸡,在24h时在大部分器官,如法氏囊、关节、脾脏、肝脏、肺脏、胸腺等器官中均能检测到ARV。在4日龄时,在未接种ARV但同群饲养鸡的相应器官中亦检测到ARV。试验结果还显示,在羽毛囊中的病毒检出率与鸡内脏器官中病毒的检出率一致。这表明检测羽毛囊中ARV可用于监测ARV在鸡群的流行状态。用核酸探针检测鸡羽毛囊中ARV的方法检测ARV的感染与流行情况,便于检测大量样品中的抗原,而且取样不影响生产,具有实际应用价值。7.结语本研究在国内首次对ARV的不同野毒株的σC基因、致病性和抗原性作了系统的比较研究。从我国不同地区不同病例分离到的ARV,在单独人工感染时,均不易引起典型的临床病理变化。不同野毒株的σC基因相对保守,但不同野毒株在致病性程度和抗原性上仍有很大的差异。试验还证明,用核酸探针作分子杂交从羽毛囊中检测ARV在鸡群中的感染状态,是一种比较经济实用的方法。

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英文缩写注释  7-9
中文摘要  9-14
英文摘要  14-20
文献综述  20-49
第一部分禽呼肠孤病毒野毒株的分离与鉴定  49-72
  试验一 10 株禽呼肠孤病毒野毒株的分离、鉴定和纯化  49-72
第二部分禽呼肠孤病毒野毒株的σc 基因与抗原性比较研究  72-92
  试验二禽呼肠孤病毒野毒株σ基因序列比较  72-85
  试验三禽呼肠孤病毒野毒株抗原性比较  85-92
第三部分不同野毒株禽呼肠孤病毒致病性研究  92-133
  试验四禽呼肠孤病毒野毒株对 SPF 鸡的致病性研究  92-113
  试验五 LY株ARV感染对v-IBDV致病性及疫苗免疫应答的影响  113-125
  试验六禽呼肠孤病毒不同野毒株对肉鸡的致病性研究  125-133
第四部分用核酸探针检测禽呼肠孤病毒感染动态  133-144
  试验七用核酸探针检测禽呼肠孤病毒感染动态  133-144
实验结论  144-145
创新点  145-146
参考文献  146-159
读博士学位期间发表论文情况  159-160
致谢  160-161

禽呼肠孤病毒野毒株σC基因、抗原性及致病性比较研究

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