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组蛋白乙酰转移酶p300对人p16～（INK4a）基因表达调控的影响及其分子机制研究
作 者: 王秀莉
导 师: 黄百渠
学 校: 东北师范大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 转录调控 表观遗传修饰 组蛋白乙酰化 p16INK4a p300 Sp1
分类号: Q75
类 型: 博士论文
年 份: 2007年
下 载: 190次
引 用: 2次
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内容摘要
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p16INK4a基因编码细胞周期蛋白依赖激酶的抑制因子,p16INK4a蛋白通过负调控CDK4/6的活性在细胞周期进行及细胞分化过程中发挥作用,因而p16INK4a基因的表达调控一直受到广泛的关注。很多证据表明,p16INK4a的表达受表观遗传修饰的调控并且与多种肿瘤的发生密切相关。尽管近来生化方面的研究表明表观遗传修饰,例如DNA甲基化和组蛋白修饰,参与了p16INK4a基因的表达调控,但是目前还没有关于组蛋白乙酰化修饰对p16INK4a基因表达调控机制的详细报道。在本文中,我们对组蛋白乙酰转移酶p300通过上调p16INK4a的表达而抑制HeLa细胞周期的进程及其可能的机制进行了深入的研究。我们的工作证实过量表达p300能抑制细胞周期的进行,而这一过程可通过small interfering RNA （siRNA）降低p16INK4a蛋白的水平而被逆转。在293T细胞中,p300参与p16INK4a的表达调控,而且p300和Sp1对p16INK4a启动子水平,mRNA水平及蛋白水平的调控作用具有协同效果。针对Sp1和p300设计的siRNA能够通过部分地抑制Sp1和p300的表达而抑制p16INK4a启动子的活性。免疫共沉淀（CoIP）和哺乳动物双杂交实验表明,Sp1和p300通过Sp1的N末端和p300的Q区的相互作用而存在于同一复合物中。p16INK4a启动子截短突变和点突变报告基因荧光素酶活性分析表明在p300和Sp1调控p16INK4a启动子活性过程中p16INK4a启动子近端的Sp1结合位点起重要作用。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实,p300通过Sp1招募到p16INK4a启动子区域;p300固有的乙酰转移酶活性在p300参与p16INK4a的表达调控中是必需的;p300通过增强p16INK4a启动子区域的组蛋白H4的乙酰化水平促进p16INK4a基因的启动子活性。我们的研究工作将有助于更好的阐述p16INK4a基因转录调控的特异机制,并为基于p16INK4a的基因治疗提供重要的理论基础。
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全文目录
中文摘要 4-5
英文摘要 5-9
第一部分 研究背景 9-44
一、人p16~(INK4a)基因及其转录调控机制的研究进展 9-20
(一) 细胞周期调控的分子机制 9-13
(二) 人p16~(INK4a)基因的概述 13-17
(三) 人p16~(INK4a)基因的转录调控 17-20
二、组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控 20-42
(一) 真核生物的染色质结构与转录调控的关系 21-23
(二) 组蛋白乙酰化修饰与转录调控 23-25
(三) 蛋白乙酰化修饰酶 25-32
(四) p300/CBP复合物的研究进展 32-42
三、本论文研究的内容和意义 42-44
(一) 立题依据 42-43
(二) 本文的研究内容和意义 43-44
第二部分 实验材料与方法 44-63
一、实验材料 44-46
(一) 质粒 44
(二) 报告基因质粒的构建 44-45
(三) 蛋白和抗体 45
(四) 哺乳动物细胞系 45
(五) 试剂 45-46
二、实验方法 46-63
1. 分子生物学试验方法 46-56
(一) 分子克隆 46
(二) DNA的琼脂糖电泳 46
(三) 质粒大量制备的方法 46-48
(四) 哺乳动物细胞总RNA的提取和反转录 48-49
(五) 逆转录 49-50
(六) PCR和荧光适时定量realtime PCR 50-51
(七) 染色质免疫沉淀实验 51-53
(八) 电泳迁移率分析（EMSA） 53-55
(九) RNA 干涉(RNAi) 55-56
11. 细胞生物学实验方法 56-62
(一) 哺乳动物细胞系的培养 56
(二) 真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测 56-57
(三) 脂质体转染 57-58
(四) 蛋白质的Western Blotting 分析 58-60
(五) 免疫共沉淀实验 60-61
(六) 集落形成实验 61
(七) 流式细胞术 61-62
III. 统计分析 62-63
第三部分 实验结果与分析 63-83
一、p300通过上调p16~(INK4a)的表达诱导细胞周期停滞 63-64
(一) p16~(INK4a)的过表达抑制HeLa细胞增殖 63
(二) p300 通过上调p16~(INK4a)的表达诱导细胞周期停滞 63-64
二、p300 促进p16~(INK4a)基因的表达 64-65
三、p300与Sp1协同促进p16~(INK4a)基因的转录活性 65-67
(一) Sp1增强p16~(INK4a)启动子报告基因荧光素酶活性并促进其mRNA水平 65-66
(二) p300与Sp1协同促进p16~(INK4a)的表达 66-67
四、p300通过Q区与Sp1相互作用 67-70
五、p300被招募到p16~(INK4a)启动子区域，并且其乙酰转移酶活性在调控p16~(INK4a)的表达中起重要作用 70-71
(一) p300被招募到p16~(INK4a)基因启动子区 70
(二) p300的乙酰转移酶活性在调控p16~(INK4a)基因转录中起重要作用 70-71
六、Sp1招募p300到p16~(INK4a)启动子区域 71-75
(一) Sp1结合在p16~(INK4a)启动子区域 71-73
(二) Sp1招募p300到p16~(INK4a)启动子区域 73-74
(三) Sp1的表达提高p16~(INK4a)启动子组蛋白H4的乙酰化水平 74-75
七、p300促进Sp1在p16~(INK4a)启动子上的结合 75-76
八、应答p300转录激活的p16~(INK4a)启动子区域Sp1结合位点的鉴定 76-83
(一) 通过截短突变和点突变来鉴定应答p300转录激活的p16~(INK4a)启动子区域Sp1结合位点 76-77
(二) p16~(INK4a)基因启动子D位点在p16~(INK4a)表达调控中起重要作用 77-81
(三) p16~(INK4a)基因启动子D位点参与p300转录激活p16~(INK4a)启动子活性 81-83
第四部分 讨论 83-87
一、利用小干涉RNA技术诱导基因启动子区域高甲基化 83
二、p300通过上调p16~(INK4a)的表达诱导细胞周期的停滞 83-84
三、p300通过Sp1招募到p16~(INK4a)启动子区域 84
四、p300与Sp1之间作用方式的探讨 84-85
五、p300的乙酰转移酶活性在调控p16~(INK4a)表达过程中起重要作用 85-86
六、应答p300的p16~(INK4a)启动子区域的Sp1结合位点的探讨 86-87
主要结论和创新点 87-88
一 主要结论 87
二 主要创新点 87-88
参考文献 88-105
附录 105-107
致谢 107-108
在学期间公开发表论文及著作情况 108
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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