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蛋白激酶NUAK1的定位及其与NF-kB信号通路关系的探讨

作　者: 杨兰兰
导　师: 刘先俊；李佳
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: NUAK1/ARK5 NF-kB 239细胞核定位转录调控
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:作为AMPK家族成员之一的NUAK1,是一个肿瘤恶化相关因子,牵涉到抑制肿瘤细胞的凋亡及肿瘤细胞的浸润和转移等,本文意在确定蛋白激酶NUAK1的定位,检测其是否参与NF-kB信号通路,为后续研究NUAK1在NF-kB信号通路的具体机制奠定基础,最终目的是确认NUAK1是否是治疗癌症的关键靶点。方法:本课题采用标准质粒构建流程构建质粒NUAK1-pEGFP、NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NUAK1( D178N )-pcDNA 3.1,其中显性失活突变体的克隆采用的是两步PCR法。NUAK1的定位是通过NUAK1-pEGFP顺转于293细胞,然后用DAPY染核,最后在荧光显微镜下观察。为了检测NF-kB荧光酶素报告基因的活性,我们把构建好的质粒NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NUAK1( D178N )- pcDNA 3.1过转于293细胞中,用载体pcDNA 3.1所带的标签抗体做western blotting检测构建的质粒是否正确表达。然后以空载pcDNA3.1作对照,分别将以上两种质粒过表达于带稳转有NF-kB荧光酶素报告基因质粒的293细胞株中,检测在有或没有TNFα刺激下的NF-kB荧光酶素报告基因的活性。为进一步确认,设置了个质粒浓度梯度实验。结果:测序结果显示成功构建质粒NUAK1-pEGFP、NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NUAK1( D178N )-pcDNA 3.1。荧光显微镜下观察,在293细胞中,NUAK1定位于细胞核。Western blotting结果显示所构建质粒NUAK1-pcDNA3.1和显性失活突变体NUAK1( D178N )-pcDNA 3.1均能在293细胞系中稳定表达。NF-kB荧光酶素报告基因的活性检测结果显示在TNFα的刺激下,以空载和显性失活突变体为对照,NUAK1显著抑制NF-kB的活性,且和其表达量成正相关。结论:由于NUAK1定位于细胞核中,且显著抑制TNFα刺激下NF-kB的活性,所以NUAK1可能参与NF-kB的转录调控。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-17
第一部分相关质粒构建  17-29
  1 实验材料  17-19
  2 质粒构建流程图  19-20
  3 实验方法  20-26
  4 实验结果  26-27
  5 小结  27-29
第二部分蛋白激酶NUAK1 的定位及其与NF-kB 信号通路关系的探讨  29-46
  1 实验材料  29-36
  2 实验方法  36-42
  3 实验结果  42-45
  4 小结  45-46
第三部分总结  46-48
参考文献  48-53
文献综述  53-70
  参考文献  64-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间发表的论文  71

蛋白激酶NUAK1的定位及其与NF-kB信号通路关系的探讨

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