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重配H1N1亚型流感病毒减毒疫苗株的研究

作　者: 杨鹏辉
导　师: 温博海；王希良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 流感病毒 H1N1亚型反向遗传技术基因重排减毒活疫苗株
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

流感是由流感病毒(influenza virus)引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，在世界各国广泛流行，是危害人类健康的重要传染病之一，因此，WHO宣布对流感要严加监控。20世纪曾有过3次全球性的流感大流行，仅第一次大流行(1918～1919年)就造成2000多万人死亡，比第一次世界大战死亡的总人数还要多，而且死亡的大多数是青壮年，造成巨大的社会和经济损失。据国家权威部门透露，我国每年流感的发病高达10亿人次以上，经济损失数百亿元以上。近些年来，我国的生态环境严重破坏，人流感的发生和发展规律发生了较大变化，发病频率上升，造成了严重的社会影响和重大的经济损失。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种含有8个不同基因片段的分节段RNA病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中A型流感病毒对人类危害最严重，它引起的并发症危害大，造成神经-内分泌-免疫网络的紊乱，已严重影响人类健康和国家经济建设。A型人流感病毒自发现以来，曾出现过三种亚型：1918～1919年西班牙流感流行的是H1N1亚型；1957年之前H2N2亚型出现，而H1N1亚型消失了；1968年H3N2亚型出现，而H2N2至今没有出现；1977年H1N1再次出现，而至今H1N1亚型仍是流行主型，它引起的流感大流行对人类社会的严重危害性和公共卫生意义都受到关注。编码流感病毒的抗原主要有血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、核蛋白(Nuclear Protein，NP)和基质蛋白M(Matrix2)等多肽分子。由于HA、NA高度变异决定着病原体的特殊性，致使每年都有新的病毒株出现，给流感的防控带来了难题。目前，对于流感尚无有效的治疗手段，而疫苗免疫接种发挥着重要的作用。流感疫苗经过五十多年的发展，主要有灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗。由于流感病毒的抗原变异性大，使得疫苗生产每年都需要更换病毒株。当前使用的注射三价灭活疫苗有效，但在保护效果，特别是交叉免疫保护和接种策略上还不理想；亚单位疫苗使用安全，主要针对HA、NA抗原，有一定的免疫保护效果，但是制备周期长，对于季节性流感来说不太实用，并且保护谱不全面；DNA疫苗起步较晚，主要针对某一保护性抗原成分设计，仍然是保护不全面，另外抗原用量大、特别是潜在基因整合等瓶颈问题：而传统的减毒活疫苗可以诱导包括细胞免疫、体液免疫和局部免疫在内的较全面的免疫效应，但仍保留一定残余毒力，存在潜在的“返祖”现象，因此迫切需要发展新的疫苗研制手段。近年来，反向遗传技术的诞生为减毒活疫苗的发展提供了良好的契机。目前，基于RG(reverse genetics，RG)技术的流感减毒活疫苗成为流感疫苗发展的方向，1999年Neumann等、Hoffmann等学者建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传技术，为流感减毒活疫苗的研制提供了新的思路。以冷适应减毒病毒株为背景，拯救重配的流感减毒活疫苗株，进而研发新一代的流感减毒活疫苗是当今流感疫苗研究的热点。本研究采用反向遗传技术，通过8质粒流感病毒拯救系统，以冷适应流感病毒株A／Ann Arbor／6／60(H2N2)的6个内部基因为病毒骨架，与2006～2007年流感病毒株A／New Caledonia／20／99(H1N1)的HA和NA基因重排，建立了重配冷适应H1N1亚型流感病毒株拯救体系，为流感减毒活疫苗的研发开辟了新的思路，同时为流感的安全、有效免疫预防提供研制策略和理论依据。主要研究内容包括：一、双向转录／表达载体pAD3000的构建要想得到拯救成功的重配流感病毒株，必须要有一套完善的拯救体系，而在拯救体系中，表达载体起着至关重要的作用。为了使得转染质粒在拯救系统中能够高表达，提高其在细胞中的转录翻译水平，我们对载体pHW2000进行了改造，根据转染所用细胞的类型，选择用SV40的多聚A(polyA)信号序列取代牛生长激素(BGH)的多聚腺苷酸信号序列，以期获得高效的转染效率和病毒拯救效率，为流感减毒活疫苗的制备提供理论基础。根据相关文献报道，利用pcDNA3.1(+)质粒为模板，扩增得到了SV40的多聚A(polyA)信号序列，该片段大小为138bp。同时从国外得到的双向转录／表达载体pHW2000，是在pcDNA3.0的基础上经过一系列的改造而演化而来的，在该载体的基础上，我们将其升级为双向转录／表达载体pAD3000，通过PCR扩增和测序验证基因序列是完全正确的，并且利用序列分析软件对其全序列进行了分析。以上工作为流感病毒8质粒系统转录／表达载体的构建奠定了基础。二、流感病毒8质粒系统的构建利用构建好的双向转录／表达载体pAD3000载体系统，我们选择冷适应、减毒的流感病毒株A／Ann Arbor／6／60的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)作为拯救病毒骨架，人工合成其基因全序列，同时引入PB1-391E，581G，661T，PB2-265S，NP-34G5个氨基酸的突变位点，根据已发表的序列设计扩增6个基因的特异引物对。将2006～2007年WHO宣布的H1N1亚型流感病毒疫苗株A／New Caledonia／20／99，接种10～11日龄SPF鸡胚增殖，通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒，提取基因组总RNA，反转录成cDNA。根据Hoffmann等发表的通用引物序列扩增HA和NA基因并测序。为获得准确的5’和3’端序列，在PCR过程中采用高保真聚合酶，且挑选8～10个克隆测序，保证序列的准确性。经序列分析软件比对，得到拼接出含5’和3’端非编码区的8个基因的全长序列。设计带有BsmBⅠ、BsaⅠ或AarⅠ酶切位点的引物扩增A／Ann Arbor／6／60的6个内部基因片段和A／New Caledonia／20／99的HA和NA基因，分别克隆入pAD3000，并进行了测序验证，从而构建了8个polⅠ-polⅡ系统的转录／表达质粒，分别命名为pMDV-A-PB2，pMDV-A-PB1，pMDV-A-PA，pMDV-A-NP,pMDV-A-M，pMDV-A-NS，pMDV-A-HA，pMDV-A-NA，以期通过同一个载体、转染后利用细胞中的polⅠ和polⅡRNA聚合酶、实现vRNA和mRNA的转录和表达，为冷适应H1N1亚型流感病毒减毒株的构建提供了保证。三、重配H1N1亚型流感病毒减毒株的制备1、冷适应流感病毒拯救系统的验证用A／New Caledonia／20／99的2个表面基因(HA和NA)或冷适应病毒株A／Ann Arbor／6／60的任意一个内部基因，而其它内部基因来自A／PR／8／34，进行所有组合的基因重排，即8种7+1和1种6+2组合形式，将相应的转录／表达质粒组合，共转染COS-1细胞，均产生了预期组合、有感染性的H1N1亚型流感病毒，表明构建的8个转录／表达载体均能有效工作，且冷适应病毒株的6个内部病毒骨架能够协同发挥作用，为进一步筛选和构建重配冷适应流感病毒株奠定了基础。同时用整合A／PR／8／34的8个基因的重组质粒作阳性对照，也产生了转染子病毒。在这个过程中，优化共转染体系，在35mmdish上即可产生足以直接用鸡胚增殖的子代病毒。对7+1组合的PB2／PR8、PR8转染子代病毒及6+2组合的PR8／rMDV-A进行了初步鉴定和部分生物学特性分析。经电镜观察，转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似。RT-PCR表明引入的氨基酸突变在子代病毒中存在。HA、HI和IFA(indirect immunofluorecent assay，IFA)显示有重配病毒产生。PR8／rMDV-A的PFU结果表明低温如33℃更利于重配病毒的繁殖，经过鸡胚传代和MDCK感染实验，PR8／rMDV-A病毒能在鸡胚中高滴度增殖，感染鸡胚的能力强，这与提供表面基因的A／PR／8／34病毒株相似，而且对鸡胚的毒力弱、低温利于病毒增殖这又与提供6个内部基因的A／Ann Arbor／6／60相似。以上这些实验结果证实了冷适应病毒拯救系统的有效性。2、H1N1流感病毒减毒疫苗株的拯救及鉴定利用验证好的冷适应的流感病毒6个质粒系统，作为拯救流感病毒的骨架，与构建好的2006～2007年流感病毒株A／New Caledonia／20／99(H1N1)的HA和NA基因进行重排，8个重组质粒共转染COS-1细胞，成功得到了重配H1N1亚型流感减毒病毒株，拯救的流感减毒株在第一代鸡胚尿囊液中病毒效价为1:512～1:1024，连续传4代之后，发现病毒效价稳定，各代之间HA和NA基因的同源性达99.9％以上，经电镜观察发现重配病毒的形态与野生流感病毒株没有明显差别，并对其生物学特性进行了初步的鉴定，深入的研究工作还在进行之中。以上建立的反向遗传系统重配冷适应H1N1亚型流感病毒株，为流感病毒减毒活疫苗的研制和黏膜免疫机制研究奠定了坚实的基础。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
前言  14-18
第一部分双向转录/表达载体pAD3000的构建  18-28
  材料与方法  18-22
  结果  22-26
  讨论  26-27
  结论  27
  参考文献  27-28
第二部分 H1N1亚型流感病毒8质粒拯救系统的构建  28-42
  材料与方法  29-35
  结果  35-38
  讨论  38-39
  结论  39-40
  参考文献  40-42
第三部分重配H1N1亚型流感病毒株的拯救及鉴定  42-66
  材料和方法  43-50
  结果  50-57
  讨论  57-63
  结论  63
  参考文献  63-66
全文小结  66-67
文献综述  67-88
缩略词一览表  88-90
附录  90-93
博士期间发表及待发表的论文  93-94
致谢  94

重配H1N1亚型流感病毒减毒疫苗株的研究

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