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甲型H1N1流感病毒Real-Time RT-PCR检测内参照品的研究

作　者: 张永辉
导　师: 周红宁；王岳
学　校: 大理学院
专　业: 病原生物学
关键词: 流感病毒 Real-Time RT-PCR 内参照品假病毒颗粒 H1N1
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：制备甲型HIN1流感病毒 Real-Time RT-PCR检测的内参照品。方法：首先合成得到甲型H1N1流感病毒膜蛋白HA和NA的基因,并将其重组到质粒pCMV中得到pCMV-HA和pCMV-NA;在甲型H1N1流感病毒的M基因、HA基因、NA基因、NP基因分别设计一套引物和探针,并以其为模板设计合成一段内参基因IC,将IC插入报告质粒EGFP中得到质粒EGFP-IC;将膜蛋白质粒、报告质粒和包装质粒共同转染293T细胞得到带有IC的假病毒颗粒。结果：通过Real-Time RT-PCR使用四套引物和探针对H1N1 (A/CA/07/2009)检测,四套引物和探针对同一浓度病毒检测M基因引物组CT12.32；HA基因引物组CT12.67；NA基因引物组CT12.73；NP基因引物组CT12.94。假病毒颗粒感染A549细胞可以看到被感染的细胞表达绿色荧光蛋白,并通过电子显微镜观察到病毒颗粒的形态。使用HA-Primer和IC-Probe检测HlNlpp RNA,原液CT11.3±0.15；1：10稀释CT.15.61±0.17；1：100稀释CT19.16±0.02；1：1000稀释CT24.4±0.19。结论：成功制备出2009H1N1病毒株Real-Time RT-PCR检测的内参照品,并通过Real-Time RT-PCR验证其可行。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-8
1. 前言  8-11
2. 材料和方法  11-21
  2.1 病毒和细胞  11
  2.2 菌株和质粒  11
  2.3 细胞培养  11
  2.4 工具酶和试剂  11
  2.5 耗材和仪器  11-12
  2.6 流感病毒 H1N1膜蛋白表达型载体的构建  12-15
  2.7 流感病毒H1N12009株的检测探针和引物的设计  15-17
  2.8 内参照品检测靶标基因的构建  17-19
  2.9 细胞培养和假病毒颗粒的制作  19-20
  2.10 H1N1pp感染试验  20
  2.11 H1N1pp Real-Time RT-PCR检测  20-21
3 结果  21-25
  3.1 流感病毒H1N1膜蛋白表达型质粒的构建  21-22
  3.2 流感病毒H1N12009株的检测探针和引物验证  22-23
  3.3 重组EGFP-CI质粒构建  23-24
  3.4 假病毒感染实验和透射电子显微镜图  24
  3.5 内对照品(H1N1pp)Real Time RT-PCR结果  24-25
4 讨论  25-29
5 结论  29-30
参考文献  30-37
附录  37-43
  附录1 pCMV表达载体图谱  37-38
  附录2 EGFP报告载体图谱  38-39
  附录3 HA测序结果  39-40
  附录4 NA测序结果  40-41
  附录5 IC测序结果  41-42
  附录6 发表论文  42-43
文献综述  43-51
  参考文献  46-51
致谢  51-52

甲型H1N1流感病毒Real-Time RT-PCR检测内参照品的研究

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