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H1N1亚型流感病毒八质粒体系的冷适应拯救

作　者: 张鹏飞
导　师: 李云章；王希良
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 流感病毒 H1N1亚型反向遗传技术冷适应
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目前基于RG(Reverse genetics,RG)技术的流感减毒活疫苗成为流感疫苗的发展方向。本研究实验采用八质粒病毒拯救系统,以冷适应流感病毒株A/Amn Arbor/6/60(H2N2)的六个内部基因片段为病毒骨架,与WHO发布的2006～2007年流感病毒流行株A/New Caldonia/20/99(H1N1)的HA和NA基因进行重组拯救出了H1N1亚型流感病毒的冷适应株,为流感病毒减毒活疫苗的研发开辟了新的思路。首先运用RT-PCR方法扩增得到了2006～2007流感病毒流行株的两个表面抗原HA、NA基因片段,经测序鉴定符合流感病毒拯救要求,并成功构建了A/New Caledonia/20/99(H1N1)8质粒体系冷适应拯救的双向转录/表达质粒pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS和pAD-HA、pAD-NA。其次应用八质粒拯救体系,拯救得到了A/New Caldonia/20/99(H1N1)流感病毒的冷适应株,进一步验证了冷适应拯救体系的有效性,从而建立了以冷适应株为病毒拯救骨架的反向遗传操作技术,能有效的产生基因保真的流感病毒,并对转染体系进行了优化。H1N1亚型流感病毒冷适应株的成功拯救,也为流感病毒减毒活疫苗的研制打下了基础,但本实验拯救出的流感病毒冷适应株能否成为疫苗株,还需进一步的验证和检测。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
引言  10-32
  1 流感病毒毒力因子的研究  11-19
    1.1 通过抗原变异逃避宿主的保护性免疫  11-13
    1.2 HA 是A 型流感病毒毒力的主要决定因素  13-16
    1.3 NA 对流感病毒的毒力有一定的作用  16-18
    1.4 内部基因产物与流感病毒的毒力  18-19
  2 流感病毒反向遗传操作技术研究进展  19-32
    2.1 流感病毒及其基因组特征  20-21
    2.2 流感病毒的复制  21-24
      2.2.1 吸附、穿膜和脱壳  22-23
      2.2.2 基因组的转录与复制  23
      2.2.3 病毒蛋白的合成  23
      2.2.4 病毒粒子的装配  23
      2.2.5 病毒的出芽和释放  23-24
    2.3 病毒反向遗传操作技术体系的建立  24-26
    2.4 从克隆的 cDNA 产生负义 RNA 病毒的概况  26
    2.5 流感病毒反向遗传操作技术的历史与发展  26-32
      2.5.1 用于流感病毒复制与转录研究的系统  26-27
      2.5.2 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统  27-29
      2.5.3 能对流感病毒任何片段进行突变的一个特殊系统  29
      2.5.4 完全以克隆的 cDNA 为基础的反向遗传操作系统  29-32
实验一流感病毒八质粒冷适应拯救系统转录/表达质粒的构建  32-44
  1 材料  33-35
    1.1 病毒株  33
    1.2 主要试剂  33
    1.3 主要仪器  33-34
    1.4 分子生物学分析软件  34
    1.5 用于RNA 操作试剂和器材的DEPC 处理  34
    1.6 双向转录/表达载体  34
    1.7 冷适应株六个骨架片段  34-35
  2 方法  35-40
    2.1 基因组RNA 的提取  35
    2.2 反转录  35
    2.3 感受态细胞的制备  35
    2.4 转录/表达质粒构建:克隆流感病毒各片段 cDNA 到 pAD3000 的策略  35-36
    2.5 转录/表达质粒 pAD-HA 和 pAD-NA 的构建  36-39
      2.5.1 RT-PCR 扩增流行株HA、NA 基因  36-37
      2.5.2 连接  37
      2.5.3 转化  37
      2.5.4 菌落PCR 鉴定阳性克隆  37
      2.5.5 测序鉴定HA、NA 片段  37
      2.5.6 小提质粒  37-38
      2.5.7 酶切回收目的片段  38
      2.5.8 转录/表达载体 pAD3000 的酶切回收  38
      2.5.9 连接  38
      2.5.10 转化  38
      2.5.11 菌落PCR 鉴定阳性克隆  38-39
      2.5.12 测序鉴定  39
    2.6 转录/表达质粒 pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-NP、pAD-M、pAD-NS 的构建  39-40
      2.6.1 转化  39
      2.6.2 小提质粒  39
      2.6.3 酶切回收目的片段  39
      2.6.4 连接  39-40
      2.6.5 转化  40
      2.6.6 菌落PCR 鉴定阳性克隆  40
      2.6.7 测序鉴定  40
  3 结果  40-43
    3.1 HA、NA 基因扩增结果  40-41
    3.2 冷适应骨架基因片段  41
    3.3 转录/表达质粒 pAD-PB2、pAD-PB1、pAD-PA、pAD-HA、pAD-NP、pAD-NA、pAD-M、pAD-NS 的构建结果  41-43
  4 讨论  43
  5 小结  43-44
实验二通过反向遗传操作技术以八质粒拯救系统产生H1N1 亚型流感病毒冷适应株  44-56
  1 材料  45-46
    1.1 细胞、鸡胚  45
    1.2 主要试剂  45
    1.3 转录/表达载体的工作原理  45-46
  2 方法  46-48
    2.1 建立流感病毒反向遗传操作技术路线  46
    2.2 质粒提取  46-47
    2.3 转染前准备  47
    2.4 转染  47
    2.5 重组病毒验证  47-48
      2.5.1 RT-PCR 验证  47
      2.5.2 MDCK 细胞感染  47
      2.5.3 免疫荧光鉴定重组病毒  47-48
      2.5.4 电镜形态观察  48
  3 结果  48-51
    3.1 转染前细胞状态  48
    3.2 重组病毒血凝试验结果  48-49
    3.3 重组病毒RT-PCR 验证结果  49
    3.4 MDCK 细胞感染结果  49-50
    3.5 重组病毒免疫荧光结果  50
    3.6 重组病毒电镜形态观察结果  50-51
  4 讨论  51-55
    4.1 关于八质粒系统的工作原理  51-52
    4.2 关于 H1N1 亚型重组病毒和野生型 A/New Caldonia/20/99 的一些特性比较  52-53
    4.3 提高拯救效率应注意的问题  53-55
  5 小结  55-56
结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-69
作者简介  69

H1N1亚型流感病毒八质粒体系的冷适应拯救

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