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Pseudomonas putida ZWL73降解4-氯硝基苯的研究

作　者: 镇达
导　师: 周宁一
学　校: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
专　业: 微生物学
关键词: 4-氯硝基苯代谢途径假单胞菌活性位点 2-氨基-5-氯酚-1,6-双加氧酶
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Pseudomonas putida ZWL73分离于4-氯硝基苯（4CNB）污染土壤,可以以4CNB为唯一的碳氮源生长,并从底物释放氯离子和铵根离子。通过对降解菌的细胞提取物的酶学分析检测到对4CNB的硝基还原酶活性及推测的开环底物2-氨基-5-氯酚（2A5CP）的开环双加氧酶活性,结合生长底物范围因素（如完全还原产物对氯苯胺不能被利用生长）以及通过GC-MS检测到对氯亚硝基苯在培养基中的生成和转化实验结果,推测ZWL73是通过部分还原途径降解4CNB。质粒消除和接合转移显示降解菌具有的100kb的质粒参与了4CNB的降解,其证据来自于:质粒消除菌失去了野生型所具有的硝基还原酶和2A5CP开环双加氧酶活性;质粒消除后的菌株不能在底物培养基上生长,而其质粒转移到受体菌后使后者获得了在4CNB上生长的能力。ZWL73是第一个鉴定了4CNB的降解途径编码在质粒上的菌株。通过构建质粒DNA文库,筛选得到一个具有对2A5CP具有活性的克隆子,通过亚克隆得到一个4.9kb EcoRI片段,测序后对序列分析表明片段上的两个基因cnbCaCb分别编码了间位开环双加氧酶的β和α亚基;在大肠杆菌中过量表达的蛋白显示了对2A5CP及2-氨基酚（2AP）的活性,同时对邻苯二酚及原儿茶酸具有较弱的活性;对2A5CP及2AP的K_m值分别为4.117、7.954μM,说明2A5CP是2A5CP双加氧酶（2A5CPDO）的天然底物。进化分析表明2A5CP双加氧酶属于classIII的间位开环双加氧酶; CnbCa与其它2AP开环双加氧酶具有较近的亲缘关系,但是与其它不同来源的classIII间位开环双加氧酶的序列一致性很低（8.3-18.7%）;2A5CPDO的两个亚基具有25.8%一致性,但是α亚基序列缺少酶活性中心必要的保守His位点。可以推测两个亚基具有共同的进化起源并与其它2AP开环双加氧酶形成一个classIII间位开环双加氧酶中的新的亚类。通过氨基酸序列的多重序列比对分析推测2A5CPDOβ亚基CnbCa的三个保守His残基His13、His62、His195在催化活性中心可能是辅基Fe²⁺的结合位点。通过构建含有突变位点cnbCaCb的重组表达载体和过量表达获得了分别含有H13A、H62A和H195A（His突变为Ala）突变的突变蛋白。对含突变氨基酸的2A5CPDO活性分析表明三个突变蛋白均失去了野生型的活性。突变蛋白和野生型氨基酸序列

全文目录

简写说明  11-12
图表目录  12-15
第1章引言  15-42
  1. 环境污染、芳香烃污染与微生物降解  16-18
    1.1 环境污染、芳香烃污染与毒害作用  16-17
    1.2 芳香烃污染物的微生物降解  17-18
    1.3 芳香烃污染物生物治理  18
  2. 硝基芳香烃生物降解研究进展  18-36
    2.1 降解硝基芳香烃的微生物  19
    2.2 降解硝基芳香烃的初始代谢途径  19-27
      2.2.1 氧化代谢途径  19-23
      2.2.2 还原代谢途径  23-27
    2.3 硝基芳香烃降解的开环步骤  27-36
      2.3.1 邻位开环途径  27-30
      2.3.2 间位开环途径  30-36
  3 氯代芳香烃化合物生物降解的研究进展  36-40
    3.1 氯代芳香烃污染与毒性  37
    3.2 氯代芳香烃的有氧脱氯  37-39
    3.3 氯代芳香烃的厌氧脱氯  39-40
  4 本研究背景、目的及意义  40-42
第2章：Pseudomonas putida ZWL73 降解4-氯硝基苯的基本特性  42-50
  2.1 材料与方法  42-44
    2.1.1 菌株及培养方法  42-43
    2.1.2 试剂  43
    2.1.3 降解菌细胞提取物（粗酶）的制备  43
    2.1.4 蛋白浓度测定  43-44
    2.1.5 硝基还原酶活性测定  44
    2.1.6 开环酶2-氨基5-氯酚1,6-双加氧酶（2A5CPDO）活性测定  44
  2.2 结果与分析  44-49
    2.2.1 ZWL73 的硝基还原酶活性及其与4CNB 代谢的关系  44-46
    2.2.2 ZWL73 的2A5CPDO 活性及与4CNB 代谢的关系  46-48
    2.2.3 ZWL73 降解4CNB 的部分还原途径  48-49
  2.3 讨论  49-50
第3章：硝基还原酶及开环酶基因在P. Putida ZWL73 中的定位  50-59
  3.1 材料与方法  51-53
    3.1.1 菌株及培养方法  51-52
    3.1.2 试剂  52
    3.1.3 质粒消除  52-53
    3.1.4 质粒消除菌利用4CNB 的生长能力检测  53
    3.1.5 对质粒消除菌的硝基还原酶及开环酶基因的PCR 检测  53
    3.1.6 质粒消除菌酶液制备及酶活检测  53
  3.2 结果与讨论  53-58
    3.2.1 质粒消除菌的获得  53-54
    3.2.2 硝基还原酶及开环酶基因的PCR 检测  54-58
    3.2.3 质粒消除菌的酶活  58
  3.3 讨论  58-59
第4章：P. Putida ZWL73 质粒文库的构建、开环酶基因克隆的筛选  59-73
  4.1 材料与方法：  61-66
    4.1.1 菌株和质粒  61-62
    4.1.2 试剂  62
    4.1.3 质粒DNA 文库的构建  62-65
    4.1.4 开环酶基因克隆的筛选  65-66
  4.2 结果与讨论  66-72
    4.2.1 质粒文库的构建  66-71
    4.2.2 开环酶基因的克隆  71-72
  4.3 讨论  72-73
第5章：P. Putida ZWL73 开环酶基因的亚克隆、测序和序列分析  73-90
  5.1 材料与方法  73-76
    5.1.1 菌株和质粒  73-74
    5.1.2 试剂  74
    5.1.3 常用分子生物学技术  74-75
    5.1.4 酶蛋白的诱导表达及粗酶制备  75
    5.1.5 亚克隆的开环双加氧酶活性测定  75-76
    5.1.6 测序及基因功能分析  76
    5.1.7 间位开环双加氧酶进化分析  76
  5.2 结果与分析  76-80
    5.2.1 开环双加氧酶基因的亚克隆  76-77
    5.2.2 测序及基因功能分析  77-80
    5.2.3 间位开环双加氧酶进化关系  80
  5.3 讨论  80-90
第6章：P. putida ZWL73 的2A5CPDO 过量表达和酶学特性研究  90-99
  6.1 材料与方法  90-93
    6.1.1 菌株与质粒  90-91
    6.1.2 试剂  91
    6.1.3 表达中间载体的构建  91-92
    6.1.4 重组表达载体pZWZD3 的构建  92
    6.1.5 CnbCaCb 蛋白诱导表达  92
    6.1.6 SDS-PAGE  92
    6.1.7 2A5CPDO 对不同底物活性的测定  92-93
    6.1.8 K_m 值测定  93
  6.2 结果与分析  93-98
    6.2.1 2A5CPDO 在T7 启动子下的过量表达  93-94
    6.2.2 2A5CPDO 对不同底物活性  94-97
    6.2.3 2A5CPDO 的天然底物  97-98
  6.3 讨论  98-99
第7章：P. putida ZWL73 的2A5CPDO 催化亚基保守活性位点突变研究  99-109
  7.1 材料与方法  99-103
    7.1.1 菌株与质粒  99-100
    7.1.2 试剂  100
    7.1.3 Overlap Extension PCR 构建突变蛋白的重组表达载体  100-102
    7.1.4 突变蛋白的表达  102
    7.1.5 突变蛋白的酶活测定  102-103
    7.1.6 蛋白二级结构分析  103
  7.2 结果与分析  103-106
    7.2.1 活性中心His 残基分析  103
    7.2.2 定点突变载体的构建及蛋白表达  103-104
    7.2.3 酶活测定及分析  104-106
    7.2.4 突变蛋白二级结构分析  106
  7.3 讨论  106-109
第8 章：结论及后续工作设想  109-111
参考文献  111-123
发表及待发表文章  123-124
致谢  124

Pseudomonas putida ZWL73降解4-氯硝基苯的研究

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