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镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用
作 者: 雷磊
导 师: 黄巧云;李友国
学 校: 华中农业大学
专 业: 环境科学
关键词: 猴金属硫蛋白 野油菜黄单胞菌 冰晶核蛋白 镉 细胞表面展示 恶臭假单胞菌
分类号: X172
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 27次
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内容摘要
本研究以野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)为运载蛋白,采用C端融合的方法,将猴金属硫蛋白α结构域四聚体(mMT4α)成功展示在重金属高度耐受性恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X4菌株(以下简称X4)的细胞表面,并测定了工程菌镉吸附能力及其与多种植物共生条件下的镉吸附能力。实验结果表明,与出发菌相比,重组工程菌具有更高的镉吸附能力。基于广宿主载体pTR102,将PCR得到的野油菜黄单胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端基因inaX-N和mMT4α基因进行融合表达,并在其上游加入镉响应启动子CadR元件,构建表面展示载体pCIM,通过电转化转入恶臭假单胞菌X4。在100μmol/L镉离子浓度下诱导融合蛋白表达并在X4表面展示。通过细胞分级实验和SDS-PAGE分析等方法对inaX表面展示效率进行验证。镉胁迫生长曲线和比生长速率证明工程菌X4/pCIM具有比出发菌株X4更高的镉耐受性,工程菌X4/pCIM的镉最低抑菌浓度比出发菌株X4高2 mmol/L。此外,本研究还测定了生长态条件和静息态条件下X4/pCIM和出发菌株X4对镉的吸附作用,工程菌对镉的吸附量比出发菌株高出2倍以上,静息态条件下的吸附结果表明吸附过程在5 min内时间完成。工程菌X4/pCIM和出发菌株X4在水培条件下与小麦、豇豆、玉米根际定殖共生与镉相互作用结果显示:工程菌X4/pCIM和出发菌株X4与植物共生都表现出钝化重金属,保护植物生长的作用。其中工程菌X4/pCIM与植物的共生体系比出发菌株X4与植物共生体系表现出更强的镉吸附能力
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全文目录
目录 4-6 摘要 6-7 Abstract 7-9 缩略语表 9-10 1.前言 10-21 1.1 金属结合蛋白 10-13 1.1.1 金属硫蛋白 10-12 1.1.2 人工合成金属结合肽 12 1.1.3 植物螯合素 12 1.1.4 金属吸附专一性改造 12-13 1.2 细胞表面展示工程菌 13-16 1.2.1 微生物细胞表面展示技术简介 13 1.2.2 运载蛋白 13-15 1.2.3 靶蛋白 15 1.2.4 出发菌株选择 15-16 1.2.5 细菌表面展示系统类别 16 1.3 植物根际圈修复重金属污染 16-19 1.3.1 植物根对重金属的吸收 16-17 1.3.2 根际微生物对重金属吸附的影响 17-19 1.3.3 根际分泌物对重金属吸附的影响 19 1.4 研究目的和意义 19-21 2 材料与方法 21-30 2.1 质粒和菌株 21-22 2.2 引物与EC20的设计与合成 22 2.3 微生物及植物的培养 22-23 2.3.1 抗生素 22 2.3.2 微生物培养基 22-23 2.3.3 Hoagland's营养液 23 2.4 实验试剂 23-24 2.4.1 质粒和总DNA提取、质粒转化时相关试剂 23-24 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE电泳试剂 24 2.4.3 酶切、酶连、PCR和DNA回收试剂 24 2.5 仪器 24-25 2.6 实验方法 25-30 2.6.1 质粒构建与蛋白表达 25-26 2.6.2 菌体镉吸附实验 26-28 2.6.3 工程菌植物共生水培实验 28-30 2.6.4 EC20的获得与检测: 30 3 结果与分析 30-39 3.1 质粒构建与蛋白表达 30-32 3.2 工程菌镉抗性测定 32-34 3.3 工程菌镉吸附量测定 34-36 3.4 植物与工程菌共生水培实验 36-39 3.4.1 植物表型的观察与测定 36 3.4.2 植物根际镉含量测定 36-39 3.5 EC20的获得 39 4 小结和讨论 39-43 4.1 小结 39-40 4.2 讨论 40-43 参考文献 43-50 致谢 50-51 附录 51-52 附录1.inaX-N-mMT4α的测序结果 51 附录2.inaX-N-mMT4α融合基因的模拟翻译结果 51-52 附录3.EC20的测序结果 52 附录4.EC20的模拟翻译结果 52
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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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