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剑尾鱼HSP70家族两成员的分子克隆及溶藻弧菌感染与免疫对其基因的诱导表达

作　者: 万文菊
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 剑尾鱼 HSP70 分子克隆 溶藻弧菌 感染 免疫
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


热应激蛋白(HSPs)是一类存在于所有生物体包括鱼类细胞内比较保守的蛋白,在遇到外界刺激时,能诱导或增强其表达,以保护细胞免受损害。即使在正常无应激情况下,许多HSPs也起着维护细胞正常功能的作用。目前主要根据分子量大小对HSPs进行分类,其中对HSP90、HSP70和低分子量HSPs (16-24 kDa)研究较为广泛。HSP70作为分子伴侣在协助新生多肽链折叠,蛋白质复合体的装配,以及调节、修护和降解变性的蛋白质方面起着重要作用。研究证明一些热应激蛋白可以作为指标测定鱼类的应激状态。鱼体在受到外界环境因子胁迫时,会生成大量的热应激蛋白,这些因素包括工业处理水、重金属离子、亚砷酸盐及寄生虫等环境因子。作为一类存在于包括鱼类在内的所有生物体细胞比较保守的蛋白,热应激蛋白在免疫学方面的应用价值也正日益受到人们的关注。研究表明,人类的许多疾病与人体内热应激蛋白的表达水平有关。由于热应激蛋白参与了生物的多种免疫应答过程,因此,外界刺激诱导生物机体产生热应激蛋白,能够增强生物对某些破坏性因子的抗性。一些病原体内的热应激蛋白尤其是HSP70家族成员具有很强的免疫原性,是免疫系统的主要靶分子。HSP70在疟原虫、锥体虫、血吸虫、利什曼原虫和分支杆菌的感染中起重要的产生免疫原性的作用。真菌中的结节型组织胞浆菌的一HSP70家族成员是细胞免疫的主要靶子。HSP70是含量最丰富的一大家族HSPs,具有高度保守的序列以及在受到环境胁迫后能够大量表达,因此以热应激蛋白70作为指标来测定鱼类的应激状态,包括感染或免疫状态可能是较为理想的选择。本研究的目的是以溶藻弧菌为代表病原菌,以标准水生实验动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)为实验对象,在病原菌感染或免疫处理后的不同时间点,分别无菌采取肝脏、心脏、头肾和脾脏组织,从mRNA表达水平上了解剑尾鱼HSP70基因的动态表达水平。在不同时间点,取脾脏淋巴细胞体外培养,检测剑尾鱼淋巴细胞增殖和白细胞介素-2活性。以期找出HSP70基因表达与剑尾鱼病原菌感染与免疫状态的关系。HSP70的基因表达采用半定量RT-PCR方法,淋巴细胞增殖和白细胞介素-2活性采用MTT法。结果表明:1.弧菌中的一种感染性较强的溶藻弧菌能感染剑尾鱼,半数致死量为2.0×108CFU/g。2.由于目前并无剑尾鱼HSP70基因序列的相关报道,本文首次得到了剑尾鱼HSP70两个成员基因的部分序列。采用RT-PCR方法扩增了实验动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)纯系RR-B的HSP70家族两个新成员的cDNA片段,并将其克隆到PMD18-T载体中测序,

全文目录


中文摘要  10-13
英文摘要  13-17
前言  17-34
  1 实验动物-剑尾鱼简介  17
  2 病原弧菌的研究概况  17-19
  3 鱼类的免疫系统与抗感染免疫  19-21
    3.1 鱼类的免疫系统  19-20
    3.2 抗感染免疫  20-21
      3.2.1 体液免疫系统  20
      3.2.2 细胞免疫  20-21
      3.2.3 环境因子对鱼类免疫能力的影响  21
  4 鱼类疫苗的研究及疫苗评价  21-23
    4.1 鱼类疫苗的研究  21
    4.2 目前鱼用疫苗的评价现状及存在的问题  21-23
  5 热应激蛋白70 的研究进展  23-33
    5.1 HSP70 的类型及特点  24-25
    5.2 热应激蛋白的基因表达调节  25
    5.3 HSP70 在组织中的表达  25-26
    5.4 HSP70 的生物学功能  26-30
      5.4.1 HSP70 的分子伴侣作用  26
      5.4.2 HSP70 参与细胞骨架的形成与修复  26
      5.4.3 HSP70 调节酶的活性  26-27
      5.4.4 HSP70 调节细胞功能  27
      5.4.5 HSP70 具有免疫调节功能  27-30
    5.5 感染对 HSPs 基因表达的影响  30-31
    5.6 热应激蛋白在水产中的应用  31-33
  6 本论文的目的、意义  33-34
第一章 溶藻弧菌对剑尾鱼致病性及组织病理学研究  34-40
  1 材料与方法  34-35
    1.1 试验鱼  34
    1.2 菌株  34
    1.3 人工感染试验  34
    1.4 病原菌的再分离和生理生化特性鉴定  34
    1.5 病理组织切片制作与观察  34-35
      1.5.1 石蜡包埋  34-35
      1.5.2 切片  35
      1.5.3 染色  35
  2 结果  35-37
    2.1 病原菌的分离及感染试验  35-36
    2.2 病原菌的生化鉴定结果  36-37
    2.3 病理组织学变化  37
  3 讨论  37-40
第二章 剑尾鱼HSP70 家族两成员cDNA 基因克隆与序列分析  40-57
  1 材料与方法  40-47
    1.1 实验材料  40-42
      1.1.1 实验动物  40
      1.1.2 菌株和载体  40-41
      1.1.3 主要药品和试剂  41
      1.1.4 培养基  41
      1.1.5 常用溶液及缓冲液  41-42
    1.2 实验方法  42-47
      1.2.1 剑尾鱼总RNA 提取  42-43
      1.2.2 引物设计  43
      1.2.3 剑尾鱼cDNA 模板第一链的合成  43
      1.2.4 核心片段的扩增  43-44
      1.2.5 琼脂糖凝胶电泳回收与纯化PCR 产物  44-45
      1.2.6 载体与基因的连接  45
      1.2.7 重组质粒的转化  45-46
      1.2.8 转化子的筛选与鉴定  46-47
      1.2.9 基因序列测定与分析  47
  2 结果  47-54
    2.1 总RNA 的提取  47
    2.2 HSP70 家族两成员的序列分析  47-54
  3 讨论  54-57
    3.1 HSP70 的转录调控  55
    3.2 HSP70 的翻译  55-56
    3.3 HSP 的降解  56-57
第三章 热应激对剑尾鱼组织内HSP70 两成员mRNA 表达影响  57-64
  1 材料与方法  57-58
    1.1 实验鱼类  57
    1.2 热应激  57
    1.3 半定量测定HSP70 两成员的表达  57-58
  2 结果  58-59
    2.1 热应激下HSP70 两家族成员在剑尾鱼组织内的表达  58-59
  3 讨论  59-64
    3.1 HSP70 与细胞的耐热性  59-60
    3.2 热休克反应的调节  60-61
    3.3 HSP 增强热耐受性的机制  61-64
      3.3.1 分子伴侣作用  61
      3.3.2 抗氧化作用  61-62
      3.3.3 抗细胞凋亡作用  62
      3.3.4 协同免疫作用  62-64
第四章 溶藻弧菌感染对剑尾鱼组织内HSP70 两成员mRNA 表达的影响  64-70
  1 材料与方法  64-65
    1.1 实验鱼类  64
    1.2 实验条件  64
    1.3 溶藻弧菌感染  64
    1.4 RT-PCR 测定 HSP70 两成员的表达  64-65
  2 结果  65-67
    2.1 溶藻弧菌感染对HSP70 成员一基因在剑尾鱼组织内表达的影响  65
    2.2 溶藻弧菌感染对HSP70 成员二基因在剑尾鱼组织内表达的影响  65-67
  3 讨论  67-70
    3.1 抗感染免疫  68-70
第五章 溶藻弧菌疫苗免疫后对剑尾鱼组织内HSP70两成员mRNA表达的影响  70-74
  1 材料与方法  70
    1.1 溶藻弧菌灭活疫苗制作  70
    1.2 疫苗的安全性检测  70
    1.3 实验条件  70
    1.4 实验方法  70
  2 结果  70-72
    2.1 溶藻弧菌疫苗免疫前后对 HSP70 成员一基因在剑尾鱼组织内表达的影响  70
    2.2 溶藻弧菌疫苗免疫前后对 HSP70 成员二基因在剑尾鱼组织内表达的影响  70-72
  3 讨论  72-74
    3.1 HSP70 与抗原呈递  72
    3.2 HSP70 与免疫反应  72-74
第六章 溶藻弧菌感染和免疫对剑尾鱼T 淋巴细胞增殖及 IL-2 活性的影响  74-84
  1 材料与方法  74-76
    1.1 材料  74
      1.1.1 实验动物  74
      1.1.2 仪器与试剂  74
    1.2 方法  74-76
      1.2.1 实验用溶藻弧菌制作  74-75
      1.2.2 实验用灭活疫苗制作  75
      1.2.3 实验动物分组、处理及被检材料的采取  75
      1.2.4 检测指标及其方法  75-76
    1.3 数据处理  76
  2 结果  76-79
    2.1 溶藻弧菌感染和免疫后剑尾鱼脾脏IL-2 诱生活性变化  76-77
    2.2 溶藻弧菌感染和免疫后剑尾鱼脾脏 T 淋巴细胞增殖变化  77-79
  3 讨论  79-84
    3.1 淋巴细胞  79-81
    3.2 1L-2 的生物学特性及其种属特异性  81-84
结论  84-85
参考文献  85-103
致谢  103-104
攻读学位期间发表论文情况  104

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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