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木酮糖激酶对酿酒酵母代谢工程菌木糖利用的影响及木糖异构酶基因的胞外表达

作　者: 沈煜
导　师: 曲音波；鲍晓明
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母木糖代谢工程木酮糖激酶木糖异构酶细胞表面工程分泌定点诱变乙醇
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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引　用: 4次
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内容摘要

燃料乙醇的生产和应用因其在经济发展和战略安全上的重大意义,越来越受到各国政府的重视。自然界中含有丰富的植物纤维资源,而目前只有3-4%的植物纤维资源被有效地利用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,在利用葡萄糖的同时,利用木糖发酵生产乙醇将有助于充分利用木质纤维素资源,降低乙醇生产成本。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统上食品及化工工业的最佳生产菌株,在工业生产中有上百年的酒精发酵应用历史,具有乙醇产量高、抗逆性强等许多优良特性,是酿酒工业生产的首选菌株。酿酒酵母菌缺乏有效转化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖,但能利用木糖的异构体形式——木酮糖。自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条:其一,主要在某些酵母及丝状真菌中,木糖经木糖还原酶(xylose reductase,XR)催化生成木糖醇,然后由木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)作用生成木酮糖,XR和XDH分别需要NADPH和NAD~+作为辅酶。其二,在某些细菌和低等真菌中,木糖通过木糖异构酶(xylose isomerase,XI)催化,直接转化为木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶(xylulokinase,XK)磷酸化生成5-磷酸木酮糖,从而进入磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)。通过代谢工程(metabolic engineering)手段,包括本试验室在内的多个工作小组已经分别在酿酒酵母中表达Pichia stipitis来源的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2,Thermus thermophilus来源的木糖异构酶基因xylA。在酿酒酵母中建立自然界存在的两种木糖代谢途径,即,木糖还原酶—木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径和木糖异构酶(XI)途径。由于具有XR-XDH途径或者XI途径的重组酿酒酵母木糖利用率低且发酵副产物木糖醇产生量较高,因而需要对代谢途径下游进行疏通。同时,由于在自然界中酿酒酵母本身不利用木糖,因此,其运输系统向细胞内运输木糖的能力也不能满足利用木糖发酵生产乙醇的需要。本文的主要研究内容在此基础上开展。木酮糖激酶(XK)催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖,是木糖代谢的限速步骤之一,处于木糖代谢物进入磷酸戊糖途径(PPP)的节点位置。超表达酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因XKS1可以加速木糖代谢流,提高酿酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
本文缩写词表  14-15
第一章绪论  15-32
  1．1 充分利用木质纤维素资源的重大意义  15-16
  1．2 木质纤维素及其利用的研究现状  16-17
  1．3 木糖的代谢  17-21
    1．3．1 木糖代谢途径  17-18
    1．3．2 发酵木糖的微生物  18-20
    1．3．3 木糖代谢工程  20-21
  1．4 酿酒酵母工程菌发酵木糖产乙醇的研究  21-27
    1．4．1 木糖代谢途径在酿酒酵母中的建立  21-24
    1．4．2 木糖代谢流下游的疏通  24-25
    1．4．3 木糖的运输  25-26
    1．4．4 辅酶工程在木糖代谢中的应用  26
    1．4．5 其他与木质纤维材料全利用产乙醇的代谢途径改造  26-27
  1．5 利用木糖的其他工程菌研究现状  27-28
  1．6 酿酒酵母分泌蛋白以及酿酒酵母表面展示系统  28-30
    1．6．1 酿酒酵母细胞表面蛋白  28-29
    1．6．2 外源基因在酿酒酵母细胞表面的锚定表达策略  29
    1．6．3 外源蛋白表达位置的检测  29-30
    1．6．4 酿酒酵母表面展示系统的应用  30
  1．7 展望  30
  1．8 本文的研究工作  30-32
第二章超表达木酮糖激酶的酿酒酵母木糖代谢工程菌的构建及其代谢产物分析  32-52
  2．1 导言  32
  2．2 材料与方法  32-39
    2．2．1 菌株和质粒  32
    2．2．2 分子克隆用酶和试剂  32
    2．2．3 培养基  32-34
    2．2．4 微生物学技术  34
    2．2．5 分子生物学方法  34-37
    2．2．6 粗酶液的制备  37
    2．2．7 酶活测定方法  37-38
    2．2．8 蛋白质含量的测定  38
    2．2．9 菌株平板生长试验  38
    2．2．10 葡萄糖木糖共发酵试验  38-39
    2．2．11 发酵生长曲线的测定  39
    2．2．12 发酵产物分析  39
  2．3 结果与讨论  39-51
    2．3．1 超表达木酮糖激酶的重组质粒的构建  39-45
    2．3．2 表达木糖代谢关键酶基因的重组菌株的构建  45-46
    2．3．3 重组菌XK酶活性测定  46
    2．3．4 重组菌株以木糖为唯一碳源的生长  46-47
    2．3．5 木酮糖激酶对重组菌株在葡萄糖木糖共底物发酵中的影响  47-51
  2．4 本章小结  51-52
第三章在酿酒酵母体外表达木糖异构酶  52-76
  3．1 导言  52
  3．2 材料与方法  52-56
    3．2．1 菌株和质粒  52-54
    3．2．2 分子克隆用酶和试剂  54
    3．2．3 培养基及培养条件  54
    3．2．4 微生物学技术  54
    3．2．5 分子生物学方法  54-55
    3．2．6 免疫荧光显微镜试验  55
    3．2．7 粗酶液的制备  55
    3．2．8 酶活测定方法  55
    3．2．9 SDS-PAGE  55
    3．2．10 菌株平板生长试验  55
    3．2．11 重组菌EBY100/pYD-xy1A的木糖生长试验  55
    3．2．12 底物产物分析  55-56
  3．3 结果与讨论  56-75
    3．3．1 a-型凝集素表面展示系统对XI的表面展示  56-61
    3．3．2 alpha-凝集素表面展示系统对XI的表面展示  61-68
    3．3．3 酿酒酵母分泌表达XI  68-75
  3．4 本章小结  75-76
第四章嗜热细菌xy1A的分子改造以及纤维堆囊菌木糖异构酶基因的克隆  76-90
  4．1 导言  76-77
  4．2 材料与方法  77-79
    4．2．1 菌株和质粒  77
    4．2．2 分子克隆用酶和试剂  77
    4．2．3 培养基及培养条件  77
    4．2．4 微生物学技术  77
    4．2．5 分子生物学方法  77-79
    4．2．6 粗酶液的制备  79
    4．2．7 酶活测定方法  79
    4．2．8 蛋白质含量的测定  79
  4．3 结果与讨论  79-89
    4．3．1 嗜热细菌xy1A的分子改造  79-86
    4．3．2 纤维堆囊菌木糖异构酶基因的克隆  86-89
  4．4 本章小结  89-90
全文总结  90-92
参考文献  92-103
致谢  103-104
在读期间已发表或录用的论文  104

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