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E-cadherin对肿瘤细胞转移进入血液循环后存活的影响及机理研究
作 者: 杨丽娟
导 师: 刘玉琴
学 校: 北京协和医学院
专 业: 病理与病理生理学
关键词: 肿瘤 E-cadherin 细胞黏附 增殖抑制 离巢凋亡
分类号: R73-3
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
恶性肿瘤转移是多阶段、多步骤、复杂而有序的过程,其中非常重要的一个环节就是肿瘤细胞进入脉管系统(血管和淋巴管)后能够存活。正常情况下细胞脱离细胞外基质,失去细胞间连接后会发生凋亡,该现象称为“离巢凋亡”,70年代Fidler等人的研究小组将肿瘤细胞直接接种到血管内,结果99%以上的细胞死亡,不能最后形成转移,说明细胞获得抵抗离巢凋亡的能力是转移成功的先决条件。细胞在生长增殖过程中大部分的生长刺激信号来自于细胞与细胞外基质的相互作用,且目前大多数关于“离巢凋亡”的研究也主要集中在细胞与细胞外基质的相互作用方面,本研究旨在研究上皮型钙黏附蛋白E-cadherin(E-cadh)在肿瘤细胞转移进入血液循环后对其存活(抗离巢凋亡)的影响并探讨其可能的机理,为后续深入认识E-cadh在肿瘤发生发展各阶段所发挥的作用奠定基础。本论文分为两个章节:第一章:稳定表达E-cadh的细胞株的建立及其生长、黏附特性的检测为了研究E-cadh对转移进入血液循环的肿瘤细胞存活产生的影响,首先需要建立实验所需的细胞模型。高侵袭性和转移性的乳腺癌细胞系或乳腺肿瘤常常伴随有E-cadh表达下调或功能失活,因此我们选择细胞内源性表达E-cadh蛋白极低,可视为无E-cadh表达的MDA-MB-231人乳腺癌细胞作为研究对象。采用脂质体转染方法将携带有E-cadh基因全长cDNAs的重组真核表达质粒E-cadh-pcDNA3转染入MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过G418筛选,Western Blot (WB)鉴定出E-cadh过表达的阳性单克隆细胞株,获得了稳定表达E-cadh的两个细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9, Ecad-231-7细胞中E-cadh的表达量较Ecad-231-9的表达量高。E-cadh表达后,肿瘤细胞的形态发生明显改变,以多边形细胞为主,细胞排列较紧密,但E-cadh表达前后细胞内Cytokeratin、Vimentin蛋白表达量无明显变化。E-cadh作为一种重要的黏附分子,我们利用三种黏附试验检测了E-cadh表达前后细胞自身粘附、与基质黏附及与其他细胞粘附能力的变化,实验结果表明,与MDA-MB-231细胞相比,Ecad-231-7和Ecad-231-9细胞的自身粘附性,与基质的粘附性及与其他细胞的粘附性均有增加(p<0.01). E-cadh介导细胞间黏附作用的发挥需要通过(3-catenin的介导,因此,采用免疫沉淀技术验证E-cadh与P-catenin之间是否存在相互作用。结果表明细胞内外源性表达的E-cadh蛋白可与内源性β-catenin蛋白发生相互作用。此外,利用WB检测E-cadh表达后对Wnt信号通路中的关键分子β-catenin及其下游靶基因cyclin D1蛋白表达的影响,结果表明E-cadh表达后,β-catenin蛋白表达增高,且细胞内Cyclin-D1蛋白表达明显下降。;E-cadh的表达导致Cyclin D1表达下调,是否影响了细胞的增殖能力,为此我们采用MTT检测E-cadh蛋白表达前后细胞生长和增殖能力变化,结果表明,E-cadh的表达能够减缓肿瘤细胞的增殖能力(p<0.01)。钙黏附蛋白(Cadherin)及连环蛋白(Catenin)复合体(Cadherin/Catenin)是一组参与细胞间联接形成,维持细胞极性,保持组织结构完整密切相关的蛋白复合体。E-cadh与P-catenin相互作用,一方面介导细胞间黏附性的改变,另一方面可通过影响P-catenin的定位、定量实现对其下游靶基因如c-myc, cyclin D1等的间接调控,从而与Wnt信号通路相互作用,共同影响肿瘤的发生发展。第二章:E-cadh对转移进入血液循环的肿瘤细胞存活(抗离巢凋亡)的影响及其机理探讨实验中,我们选用了第一部分所用的三个既有联系(同一来源)又有区别(Ecadh表达量不同)的细胞株MDA-MB-231, Ecad-231-7和Ecad-231-9。MDA-MB-231人乳腺癌细胞为Ecadh-negative,以它作为母本细胞,利用基因转移技术获得了E-cadh-positive的细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9。为了研究E-cadh表达在肿瘤细胞转移入血后对其存活的影响,我们使用超低黏附六孔板悬浮培养细胞,模拟肿瘤细胞入血(离巢后)的生存环境,同时比较肿瘤细胞在离巢前后细胞周期及凋亡的变化。此外,通过调节E-cadh功能的发挥观察细胞离巢凋亡的变化情况。首先用10%FBS贴壁培养MDA-MB-231, Ecad-231-7和Ecad-231-9三种肿瘤细胞,48 h后收获,利用流式细胞仪检测细胞周期中G0-G1期,S期,G2-M期各时期比例,结果表明三种细胞S期细胞比例分别是:37.9±2.7%,38.7±0.8%,38.9±1.4%,S期细胞比例在三种细胞间无明显差异(p>0.05);此时三种肿瘤细胞凋亡率分别是:1.9±0.1%,2.0±0.1%,2.1±0.3%,在三种细胞间亦无明显差异(p>0.05)。接下来,用10%FBS离巢培养细胞48 h,各肿瘤细胞S期细胞比例分别是:24.9±2.3%,9.9±0.8%,17.7±1.2%,较贴壁培养时均有降低(p<0.01),表明肿瘤细胞离巢后其增殖能力会受到抑制,且受抑制程度与E-cadh表达与否明显相关,E-cadh表达越高,细胞增殖受到的抑制程度越显著。此外,除了利用流式细胞仪检测细胞周期各时期细胞比例的变化,我们还通过流式细胞仪检测了贴壁和离巢培养条件下细胞的凋亡情况,对各肿瘤细胞离巢凋亡率进行比较。结果发现,离巢后,各肿瘤细胞凋亡率分别是:2.8±0.4%,4.2±0.1%,3.8±0.7%,较贴壁培养时均有增加(p<0.01),其中以Ecad-231-7细胞的离巢凋亡率增加最为明显,离巢培养后细胞凋亡率较贴壁时增加了一倍。WB检测凋亡蛋白Cleaved PARP的表达也证实了该结果,即E-cadh表达越高,其离巢凋亡率越高,提示E-cadh表达能够增加肿瘤细胞离巢凋亡的敏感性。为了进一步证明Ecad-231-7细胞在悬浮培养时所表现出来的对离巢凋亡的敏感性确实与细胞内表达的E-cadh蛋白有关,我们利用低钙培养条件阻断E-cadh介导的黏附功能的发挥,并利用血清饥饿降低细胞内E-cadh蛋白的表达水平,观察E-cadh功能阻断或表达水平降低对肿瘤细胞离巢后周期及凋亡的影响。低钙离巢培养细胞,Ecad-231-7细胞凋亡率显著增加至16±0.5%(p<0.01);WB不仅证实了该培养条件下凋亡的发生,而且证实凋亡相关蛋白cleaved PARP的表达增加与细胞内E-cadh蛋白的表达上调相关。结果表明,细胞内E-cad表达增高能够增加肿瘤细胞对离巢凋亡的敏感性。与低钙离巢培养相比,无血清离巢培养Ecad-231-9细胞后,细胞E-cadh表达下调,离巢凋亡率相应降低。综上所述,肿瘤细胞在离巢条件下其增殖会受到抑制,有E-cadh表达的肿瘤细胞受到的增殖抑制程度最为明显,E-cadh的表达存在能够增加肿瘤细胞对离巢凋亡的敏感性,不利于肿瘤细胞离巢存活。
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全文目录
目录 3-6 中文摘要 6-9 ABSTRACT 9-12 缩略语表 12-14 第一章 上皮型钙黏附蛋白与肿瘤转移 14-23 一、E-cadh分子研究现状 14-21 1、E-cadh结构与功能 14-15 2、E-cadh失活的机制 15-17 3、E-cadh参与调控的细胞信号转导途径 17-18 4、E-cadh分子与EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition) 18-19 5、E-cadh与离巢凋亡(anoikis) 19-21 二、E-cadh在肿瘤抗离巢凋亡中作用研究的目的和意义 21-23 第二章:E-cadh稳定表达细胞株的建立及其增殖、黏附特性的检测 23-46 摘要 23 引言 23-24 实验材料 24-28 一、细胞系 24 二、菌株 24 三、质粒 24 四、抗体 24 五、培养基、主要试剂及耗材 24-25 六、主要储备液及工作液的配制 25-27 七、主要仪器 27-28 实验方法 28-36 一、细胞培养 28 二、质粒转化、扩增 28 三、质粒小量提取 28-29 四、酶切鉴定E-cadh-pcDNA3质粒 29 五、琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物 29 六、质粒大量提取 29-30 七、细胞转染 30 八、转染后细胞的克隆培养 30-31 九、细胞免疫组织化学染色 31 十、细胞总蛋白的提取 31-32 十一、BCA法检测蛋白浓度 32 十二、Western Blotting 32-34 十三、免疫沉淀(IP) 34 十四、MTT法检测细胞增殖 34-35 十五、黏附实验 35 十六 统计分析方法 35-36 实验结果 36-43 一、酶切、测序鉴定E-cadh pcDNA3.0质粒 36 二、稳定表达E-cadh的转染细胞株的建立 36-37 三、E-cadh蛋白表达对肿瘤细胞形态的影响 37 四、E-cadherin蛋白表达对肿瘤细胞Cytokeratin、Vimentin表达的影响 37-38 五、MDA-MB-231人乳腺癌细胞中E-cadh蛋白的表达调控 38-40 六、E-cadh蛋白表达对肿瘤细胞黏附能力的影响 40-41 七、E-cadh表达对细胞增殖相关分子表达水平的影响 41-42 八、E-cadh表达后与细胞内β-catenin的相互作用 42 九、E-cadh蛋白表达对肿瘤细胞增殖能力的影响 42-43 讨论 43-46 第三章:E-cadherin表达对肿瘤细胞离巢凋亡的影响及其机理研究 46-59 摘要 46 引言 46-47 实验材料 47-48 一、细胞系 47 二、培养基、主要试剂及耗材 47 三、抗体 47-48 四、主要储备液及工作液的配制 48 五、主要仪器 48 实验方法 48-49 一、细胞培养 48 二、细胞总蛋白的提取 48 三、BCA法检测蛋白浓度 48 四、Western Blotting 48 五、流式检测细胞周期及细胞凋亡 48-49 六、统计分析方法 49 实验结果 49-55 一、常规培养时各肿瘤细胞增殖无差别 49-50 二、离巢后各肿瘤细胞增殖受到抑制 50 三、各种肿瘤细胞离巢时凋亡增加 50-51 四、调节E-cadh功能状态及表达对细胞凋亡的影响 51-55 讨论 55-59 参考文献 59-66 小结 66-67 附录一 67-72 一、E-cadh基因CDS序列 67-68 二、受赠载体测序结果 68-69 三、Pubmed比对结果 69-72 附录2:已发表文章 72-75 致谢 75-76 个人简历 76-78
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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