学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

α-amanitin的分离鉴定及其致病机理研究

作　者: 赵建
导　师: 杨志荣
学　校: 四川大学
专　业: 遗传学
关键词: α-amanitin 加端PCR 反相HPLC 细胞毒性 小鼠oligo芯片 差异表达基因
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 93次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


鹅膏菌属（Amanita）毒蕈原浆汁毒素根据其结构、性质主要分为鹅膏毒肽（amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）和毒伞素（virotoxins）三类。这些毒肽都是环化小分子，化学性质稳定，具有极高的应用与研究价值，α-amanitin是其中含量最高的有毒多肽之一。它们在真核生物mRNA合成的专一性抑制、基因的组织结构和细胞定位、基因的表达与调控、细胞膜转运系统、细胞结构与功能、肿瘤和病毒的研究等领域具有广阔的应用前景。但是毒蕈资源有限，都是从野生子实体中分离获得，且不易分离纯化，所以现今的各类毒肽产品全部来自于欧美，价格昂贵。这大大限制了国内科研人员对毒肽的研究和利用。 利用反相HPLC和紫外吸收光谱分析从四川三江地区采集到的鳞柄白毒鹅膏菌（Amanita virosa）。鳞柄白毒鹅膏菌子实体H2O抽提液在以0.02mol/L醋酸铵—乙腈为流动项的梯度洗脱模式下的RP-HPLC条件下，α-amanitin出峰时间约为12.22min，比较洗脱峰与α-amanitin标样浓度制成标准曲线（线性回归方程是Y=5159X+1097.4），发现鳞柄白毒鹅膏菌中α-amanitin的含量约为2838.8ug/g干子实体。 Zanotti G．等人尝试通过化学的方法先合成一种鹅膏毒肽（amaninamide）的线性骨架，然后环化生成活性毒肽，以期解决资源的问题，但是程序复杂，成本高昂。通过构建含α-amanitin八肽碳骨架编码序列融合基因的表达载体，在适宜条件下高效表达，生成的线性碳骨架可为化学合成和修饰提供前体物质基础，供进一步环化研究，也可以以前体物质的形式加入到人工培养的产α-amanitin的菌丝体培养基中，刺激其提高活性α-amanitin的产量。论文利用加端PCR技术来构建该表达载体，将两次连续加端PCR反应的产物连入表达载体pGEX-1λT，得到含α-amanitin线性八肽碳骨架编码序列的阳性重组子四川大学博士学位论文pGAT一1。测序结果显示，构建的GST一AT融合基因相位正确，阅读框通读。通过对融合基因在大肠杆菌中表达条件的优化，目的融合蛋白的表达量可提高33.5%，占总蛋白表达量的28.3%。这为利用化学手段环化a一am耐tin线性前体以及通过培养毒覃菌丝体生产活性a一amanitin的进一步研究提供了碳骨架来源，有助于对活性a一am耐tin的研究与生产。 通过对a一am耐tin致小鼠中毒机理研究发现，a一am丽tin腹腔和尾静脉注射 （给药剂量范围分别是0.6一o.gm叭g和0.25一o.45m叭g）两种给药方式下，小鼠死亡事件主要发生在给药后24h一60h时间段，小鼠死亡率概率变换值对给药浓度对数变换值存在回归关系，直线回归方程分别为户=0.0404x一0.1297（RZ一0.9662）和夕=o.o933x一0.4878（R2一0.9625），半致死计量分别为0 .742mg/kg和0.327mg/kg。 尾静脉给药与腹腔注射相比，a一am耐tin作用的起效时间更快，强度更高，说明中毒症状、死亡率与高水平的血药浓度有关。a一amhatin中毒会引起小鼠严重的肠胃炎反应和小鼠体重的急剧降低。在尾静脉给药12一%h时间段，白细胞计数、红细胞计数和血红蛋白浓度也显著降低。其中WBC小细胞计数变化趋势与白细胞计数变化趋势相似，而WBC大细胞计数在尾静脉给药12h后，就一直显著性降低，占白细胞总数的比例持续降低。血清中BLJ’N、Crea在给药12h后明显升高。24h后，ALT、AST含量分别为1308.5士109.8lU几和898.0士z97.99U/L，升高了24.0和9.64倍;TBIL、DBIL含量分别为24.21士8、49林mol几和17.74士7.25林mo比，升高了26.3、40.0倍。TP、GLOB含量在给药84h后显著下降，Alb含量在给药120h后显著下降。中毒小鼠在48h后，肝脏和肾脏的脏器指数升高。解剖和病理学研究发现，肝脏、肾脏病变严重;超微结构观察结果显示，细胞核和线粒体是敏感的细胞器。利用反相HPLC技术分析动物组织样品中a一am而tin的实验发现，尾静脉给药48h后，血浆和脾脏中不易检测到a一am耐tin的存在，而在肝脏和肾脏中可以检测到其存在。 运用MTT法研究不同浓度的a一amanitin和不同作用时间对体外传代培养的人正常肝细胞（Chang细胞株）和肝癌细胞（sc一7721细胞株）存活率的影响。研究发现，二一amanitin的使用剂量与细胞CSR存在一定关系，随着剂量的增加，细胞esR逐渐降低。7.12xlo一’omrnoFLa一amanitin作用于两种细胞24h后，就能显著抑制细胞的生长。l二四川大学博士学位论文 对Chang和sc一7721细胞CSR平方根的反正弦值与a一am耐tin浓度的对数变换值进行相关和回归分析，发现它们在a=0.05水平，双尾检验呈显著性相关;对它们进行曲线拟合，结果显示线性模型拟合最好，线性回归方程分别为Y=56.3939一1 .4824x和Y=54.7296一1 .7849x。比较由回归方程外推得到的a一am二tin对实验用两种细胞株的IC50值和小鼠半致死剂量，两者在数量级上的明显差异说明动物体较之体外培养细胞对a一am树tin更为敏感。 a一amanitin对Chang和sc一7721细胞株的毒性作用与cy的作用相比较，发现7.12XIO碑OFLa一amanitin对这两种细胞株的抑制率分别为，其毒性作用略强与10ol/L cy;而7.12xlo一’20比a一am丽tin对细胞的作用效果与2.smmol几CY相近，分别为91.55%和93.43%。两种药品对Chang、srnme一7721?

全文目录


图片目录  9-11
表格目录  11-13
中文摘要  13-17
英文摘要  17-22
第一章 α-amanitin线性碳骨架融合表达研究  22-39
  摘要  22
  关键词  22
  引言  22-23
  1 材料与方法  23-27
    1．1 材料  23-24
      1．1．1 菌种和克隆载体  23
      1．1．2 试剂盒、工具酶和生化试剂  23-24
      1．1．3 主要仪器  24
      1．1．4 引物合成与测序  24
    1．2 方法  24-27
      1．2．1 α-amanitin的分离纯化  24-25
      1．2．2 α-amanitin线性碳骨架融合基因构建与表达  25-27
  2 结果  27-36
    2．1 α-amanitin标准曲线制备  27-29
      2．1．1 色谱结果  27-28
      2．1．2 标准曲线制备  28
      2．1．3 标准曲线整合  28-29
    2．2 精密度检测  29
    2．3 RP-HPLC分离纯化α-amanitin  29-30
    2．4 加端PCR反应  30
    2．5 融合基因的构建  30-31
    2．6 DNA序列测定与分析  31
    2．7 融合基因表达条件的研究  31-36
      2．7．1 重组质粒在不同受体菌中的表达比较  31-32
      2．7．2 培养基对菌体生长及融合蛋白表达量的影响  32
      2．7．3 pH值对融合蛋白表达的影响  32
      2．7．4 装液量和转速对菌体生长和融合蛋白表达的影响  32-34
      2．7．5 不同菌体浓度对融合蛋白表达量的影响  34
      2．7．6 温度对融台蛋白表达的影响  34-35
      2．7．7 不同浓度的1PTG诱导对融合蛋白表达量的影响  35
      2．7．8 不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响  35-36
  3 讨论  36-37
    3．1 RP-HPLC技术分离α-amanitin  36
    3．2 加端PCR  36-37
    3．3 融合蛋白表达条件的优化  37
  参考文献  37-39
第二章 α-amanitin致病机理研究  39-66
  摘要  39
  关键词  39
  引言  39-40
  1 材料与方法  40-43
    1．1 材料  40-41
      1．1．1 实验动物  40
      1．1．2 试剂  40
      1．1．3 主要仪器  40-41
    1．2 方法  41-43
      1．2．1 半致死剂量确定  41
      1．2．2 α-amanitin给药对小鼠体重的影响  41
      1．2．3 α-arnanitin给药对小鼠脏器指数的影响  41
      1．2．4 α-amanitin给药对小鼠血象的影响  41-42
      1．2．5 α-amanitin给药对小鼠血清生化指标的影响  42
      1．2．6 小鼠组织病理研究  42
      1．2．7 小鼠超微病理研究  42
      1．2．8 生物样品中α-amanitin的测定  42-43
  2 结果  43-57
    2．1 给药后小鼠的临床症状及半致死剂量确定  43-47
    2．2 α-amanitin对小鼠体重的影响  47
    2．3 α-amanitin对小鼠脏器指数的影响  47-48
    2．4 α-amanitin对小鼠血象的影响  48-49
    2．5 α-amanitin对小鼠血清生化指标的影响  49
    2．6 小鼠病理组织研究  49-55
    2．7 小鼠超微病理研究  55
    2．8 生物样品中α-amanitin的测定  55-57
  3 讨论  57-64
    3．1 α-amanitin给药后小鼠的中毒症状  58
    3．2 α-amanitin对小鼠脏器指数的影响  58-59
    3．3 α-amanitin对小鼠血象的影响  59
    3．4 α-amanitin对小鼠血清生化指标的影响  59-61
    3．5 α-amanitin对小鼠的超微病理研究  61-62
    3．6 生物样品中α-amanitin的测定  62-64
  参考文献  64-66
第三章 α-amanitin对体外培养细胞毒性试验  66-86
  摘要  66
  关键词  66-67
  引言  67-68
  1 材料与方法  68-69
    1．1 材料  68
      1．1．1 细胞株  68
      1．1．2 试剂  68
      1．1．3 仪器  68
    1．2 方法  68-69
      1．2．1 试剂和细胞培养液配制  68
      1．1．2 细胞培养  68
      1．2．3 药物与细胞相互作用  68-69
  2 结果  69-72
    2．1 α-amanitin和CY浓度对细胞存活率的影响  69-71
    2．2 α-amanitin和CY作用时间对细胞存活率的影响  71-72
  3 讨论  72-84
    3．1 α-amanitin和CY浓度对细胞存活率的影响  72-79
    3．2 α-amanitin和CY作用时间对细胞存活率的影响  79-84
  参考文献  84-86
第四章 α-amanitin中毒小鼠基因差异表达研究  86-123
  摘要  86
  关键词  86-87
  引言  87-88
  1 材料和方法  88-97
    1．1 材料  88-89
      1．1．1 实验动物  88
      1．1．2 试剂盒与试剂  88
      1．1．3 主要仪器  88-89
    1．2 方法  89-97
      1．2．1 小鼠α-amanitin中毒试验对象建立  89
      1．2．2 给药前后总RNA的纯化  89-91
      1．2．3 对样品cDNA进行标记  91-95
      1．2．4 Oligo芯片制作  95
      1．2．5 杂交与清洗  95-96
      1．2．6 芯片扫描  96
      1．2．7 芯片图像的采集与数据分析  96-97
  2 结果  97-111
    2．1 总RNA的质量分析  97-98
    2．2 DNA荧光标记  98-99
    2．3 芯片杂交及图像采集  99
    2．4 数据分析  99-111
  3 讨论  111-121
    3．1 α-amanitin对DNA复制、转录等相关蛋白基因的影响  111-113
    3．2 α-amanitin对蛋白翻译、加工、转运相关蛋白基因的影响  113
    3．3 α-amanitin对信号传导相关蛋白基因的影响  113
    3．4 α-amanitin对细胞周期相关蛋白基因的影响  113
    3．5 α-amamtin对生长发育相关蛋白基因的影响  113-115
    3．6 α-amamtin对细胞凋亡相关蛋白基因的影响  115-116
    3．7 α-amamtin对免疫相关蛋白基因的影响  116
    3．8 α-amanitin对代谢相关蛋白基因的影响  116-117
    3．9 α-mnamtin对离子通道相关蛋白基因的影响  117-118
    3．10 α-amanitin对细胞骨架相关蛋白基因的影响一  118
    3．11 α-amanitin对蛋白酶基因的影响  118
    3．12 α-amanitin对外压反应蛋白基因的影响  118-119
    3．13 其它未知功能的差异性表达基因  119-121
  参考文献  121-123
小结  123-125
文献综述  125-163
  第一节 鹅膏菌科毒蕈及毒素  126-140
    1 鹅膏菌科毒蕈种类  126-129
    2 鹅膏菌毒素  129-140
      2．1 鹅膏菌科神经精神毒素  129-131
        2．1．1 毒蝇碱  129-130
        2．1．2 异噁唑衍生物  130
        2．1．3 色胺类化合物  130-131
      2．2 原浆质毒素  131-140
        2．2．1 鹅膏菌有毒多肽的分离和鉴定  131-132
        2．2．2 化学结构与性质  132-135
        2．2．3 鹅膏菌毒素毒理作用机制  135-137
        2．2．4 机体对鹅膏菌毒素的吸收  137-138
        2．2．5 鹅膏菌毒素中毒反应及病理学症状  138-139
        2．2．6 治疗与拮抗  139-140
  第二节 鹅膏菌毒素应用与展望  140-145
    1 真核细胞mRNA合成的专一性抑制剂  140-141
    2 基因的组织结构和细胞定位  141-142
    3 基因的表达和调控  142-143
    4 肿瘤和病毒的研究  143
    5 细胞结构与功能  143-144
    6 展望  144-145
  第三节 毒理基因组学与基因芯片技术  145-154
    1 毒理基因组学  145-149
      1．1 毒理基因组学概述  146-147
      1．2 毒理基因组学研究手段  147
      1．3 毒理基因组学研究进展  147-148
      1．4 毒理基因组学研究意义  148-149
    2 基因芯片技术在毒理基因组学中的应用  149-154
      2．1 DNA芯片的基本原理  149-150
      2．2 基因芯片的应用  150-151
      2．3 基因芯片在毒理学中的应用  151-154
        2．3．1 毒作用机制  151-152
        2．3．2 混合物中各物质间的交互作用  152
        2．3．3 剂量—反应关系  152-153
        2．3．4 基因突变和基因多态性分析  153
        2．3．5 将动物毒性实验外推到人  153
        2．3．6 基因芯片技术的局限性  153-154
    3 展望  154
  参考文献  154-163
致谢  163-164
在校期间发表文章情况  164-166
声明  166

相似论文

  1. 鬼臼毒素衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究,R284
  2. 新型功能化氧化石墨烯药物载体的合成及其性能研究,TQ460.4
  3. 高温胁迫条件下紫花苜蓿抑制消减cDNA文库的构建与初步分析,S541.9
  4. 棉纤维起始发育优势基因表达谱和三个新基因的克隆与功能初步分析,S562
  5. 猪链球菌2型感染小鼠腹腔巨噬细胞基因表达谱差异分析,S858.91
  6. 东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT中关键活性位点的功能分析,Q51
  7. 半导体激光和5-氟尿嘧啶缓释植入剂对口腔肿瘤细胞抑制作用实验研究,R739.8
  8. 斯氏按蚊感染约氏疟原虫后24小时差异表达基因的筛选与分析,R531.3
  9. 利谷隆致胚胎期SD大鼠睾丸发育整体基因表达水平的研究,Q75
  10. 中华稻蝗内生菌株SDLH抑菌蛋白作为防腐剂的可行性研究,TS202.3
  11. N’-芳亚甲基-2-（4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基）乙酰腙类化合物的合成及其抗肿瘤活性研究,R96
  12. GeneFishing技术解析华南忍冬高钙环境下基因表达的差异,S567.79
  13. 两种新型避孕材料遗传毒性的研究,R114
  14. 裂苞铁苋菜和紫芫花的化学成分与活性研究,R284
  15. 宫腔粘连治疗装置生物相容性研究,R318.08
  16. 机械通气所致急性肺损伤对大鼠昼夜节律改变和肺组织基因表达的影响,R563.8
  17. 儿童糖尿病易感基因的相关研究,R725.8
  18. 三种无机铅化合物的肺毒作用研究,R114
  19. 淮河流域X县水中藻毒素分布特征及水样有机提取物细胞毒性、遗传毒性与污染谱的回归模型研究,R114
  20. 利用牙鲆鳃细胞系和斑马鱼胚胎检测和评估青岛沿海底沉积物的细胞毒性、遗传毒性和胚胎致畸性,X174
  21. HIV-1抗原特异性CTL免疫应答影响因素的研究,R392

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com