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可再生纤维素原料生物转化产乳酸的研究

作　者: 沈雪亮
导　师: 夏黎明
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 纤维素酶 液体深层发酵 固定化纤维二糖酶 纤维原料 协同酶解 固定化乳酸杆菌 乳酸发酵 共固定化体系 串联式生物反应器 协同糖化发酵 基因克隆 分泌型表达
分类号: TQ922
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。利用生物技术将纤维素转化成乳酸，具有重要的社会及经济意义。本文对纤维素酶的生产、纤维二糖酶的生产及固定化、纤维原料的酶法糖化、固定化乳酸杆菌的发酵、纤维二糖酶和乳酸杆菌的共固定化，以及利用串联式生物反应器协同酶解纤维素发酵乳酸等方面进行了研究。 采用液体深层发酵工艺，对纤维素酶生产过程中的主要工艺参数进行了优化，以廉价的木糖渣和豆饼粉作为里氏木霉(Trichoderma reesei ZU-04)的碳源和氮源，大幅度降低了生产成本，并在30 m~3发酵罐中成功地完成了放大试验，纤维素酶活力高达8.16 FPIU／mL(331.7 FPIU／g纤维素)，为纤维素酶的工业化应用打下了良好的基础。 筛选到一个纤维二糖酶高产菌株(黑曲霉Asperillus niger LR-12)，对其固态发酵条件进行了优化，纤维二糖酶活力达到了国际先进水平(438.3 CBIU／g干曲)。研究发现，该菌的孢子中富含纤维二糖酶，采用海藻酸钙凝胶包埋孢子可将纤维二糖酶有效固定。包埋后的黑曲霉孢子在酶解温度(50℃)下不会萌发，但可以在凝胶珠内缓慢地释放纤维二糖酶，与直接固定酶蛋白的传统方法相比，这种新型的固定化技术具有操作经济简便、对酶活力无破坏、固定化酶的半衰期长等优点。该固定化酶在纤维素酶的协同降解过程中具有明显的促进作用。 对纤维素酶解过程中底物性质、底物浓度、纤维素酶用量及酶系组成等关键因子进行了研究。由于里氏木霉纤维素酶系中纤维二糖酶活力很低(CBA／FPA为0.03)，对经稀酸预处理后的玉米芯纤维底物的酶解得率仅为67.4％。通过添加纤维二糖酶，将CBA／FPA增加到0.42，酶解得率可提高至83.6％。进一步利用里氏木霉纤维素酶和固定化纤维二糖酶的协同作用，纤维原料的酶解得率可高达88.2％。这方面的研究结果对于深入了解纤维素酶的协同降解机制具有重要意义。 采用海藻酸钙凝胶包埋固定德氏乳酸杆菌，固定化细胞与游离细胞相比，发酵时间缩短，乳酸得率提高，并能有效地利用纤维原料水解液进行乳酸发酵，乳酸得率可达90.7％。 将纤维原料的酶解、固定化纤维二糖酶和固定化乳酸杆菌的作用有机耦联，构建成新型的三级串联式生物反应器，该反应器可有效解除纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，促进纤维原料的酶水解，乳酸浓度达55.2g/L，纤维素对乳酸的转化率高达90.6％。该反应器性能稳定，反应效率高，固定化酶和固定化细胞可以重复使用，便于自动化控制，对于优化反应工艺，降低操作成本等具有重要意义。采用分批添料式协同酶解发酵工艺，可提高纤维底物的终浓度和产物乳酸的终浓度(达105.2g／L)，有效提高了酶的利用率和乳酸生产效率。浙江大学博士学位论文摘要定在海藻酸钙凝胶珠中，并将这种共固定化体系与纤维原料的酶解过程相祸合，构建成新型的串联式生物反应器。在共固定化体系的协同作用下，纤维原料对乳酸的转化率可达91.5%。本研究工作有利于简化工艺流程，减少设备投资，提高反应效率，国内外至今尚未见到相同的研究报道。 在纤维素酶基因的克隆与表达方面做了一些探索性的研究工作:将纤维素酶ES基因在克隆质粒pDS引上酶切分离后，连接到表达质粒pSE420上，进一步将含有目的基因的表达质粒转入宿主细胞E.coll’JM109中，发酵液中的CMC酶活力达到了31.6U/mL，成功地实现了基因的表达和胞外分泌。这一工作为进一步构建高效产酶菌株打下了坚实的基础。 本文在固定化纤维二糖酶的制备、利用固定化纤维二糖酶协同降解纤维原料、利用三级串联式生物反应器优化纤维原料协同糖化发酵过程、共固定化反应体系的构建，以及利用共固定化体系组建串联式生物反应器协同降解纤维原料发酵生产乳酸等方面的研究工作具有明显的特色与创新，有关研究结果不仅有重要的学术价值，而且在促进可再生纤维素资源的转化利用、推动国民经济的可持续发展等方面具有深远意义。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一章 文献综述  13-33
  1.1 纤维素酶的性质及用途  13-17
    1.1.1 纤维素酶系的组成  13-14
    1.1.2 纤维素酶的分子结构  14-15
    1.1.3 纤维素酶的分子量及分子大小  15
    1.1.4 纤维素酶的最适反应条件及稳定性  15-17
    1.1.5 纤维素酶的抑制剂和激活剂  17
    1.1.6 纤维素酶的应用  17
  1.2 纤维素酶的生产及发展趋势  17-21
    1.2.1 生产菌种  17-18
    1.2.2 产酶工艺  18-19
    1.2.3 研究现状及发展趋势  19-21
  1.3 植物纤维原料的酶法水解  21-26
    1.3.1 纤维原料的化学组成  21-22
    1.3.2 纤维原料的预处理  22-23
    1.3.3 天然纤维素与酶作用的关系  23-24
    1.3.4 纤维素酶的降解机理  24-25
    1.3.5 影响纤维素酶降解的主要因素  25-26
  1.4 纤维原料的同步糖化发酵  26-27
  1.5 乳酸的性质、生产及用途  27-32
    1.5.1 乳酸的性质  27-28
    1.5.2 乳酸的生产方法  28-30
    1.5.3 乳酸的应用  30-32
  1.6 本文的研究思路  32-33
第二章 纤维素酶的生产  33-48
  2.1 材料与方法  33-39
    2.1.1 菌种及保藏  33
    2.1.2 原材料  33-34
    2.1.3 培养基  34
    2.1.4 液体深层发酵  34-35
    2.1.5 酶活力测定  35-36
    2.1.6 糖含量测定  36-37
    2.1.7 常用试剂及配制  37-38
    2.1.8 实验数据分析方法  38-39
  2.2 结果与讨论  39-47
    2.2.1 碳源对里氏木霉合成纤维素酶的影响  39-41
      2.2.1.1 不同碳源的诱导作用  39
      2.2.1.2 利用纤维纸浆和木糖渣产酶的比较  39-41
      2.2.1.3 木糖渣浓度对产酶的影响  41
    2.2.2 氮源的选择  41-42
    2.2.3 碳氮比对产酶的影响  42
    2.2.4 2L发酵罐产酶试验  42-44
      2.2.4.1 搅拌速度对产酶的影响  42
      2.2.4.2 通气量对产酶的影响  42-44
      2.2.4.3 里氏木霉在2L发酵罐中的产酶进程  44
    2.2.5 30m~3发酵罐产酶试验  44-47
      2.2.5.1 产酶进程  44-45
      2.2.5.2 里氏木霉纤维素酶系各组分的活力变化  45-47
  2.3 小结  47-48
第三章 纤维二糖酶的生产及固定化  48-62
  3.1 材料与方法  48-51
    3.1.1 菌种  48
    3.1.2 培养基  48-49
    3.1.3 固态发酵  49
    3.1.4 纤维二糖酶的固定化  49
    3.1.5 固定化纤维二糖酶的催化反应  49-50
    3.1.6 分析测定方法  50-51
  3.2 结果与讨论  51-61
    3.2.1 纤维二糖酶生产菌的筛选  51
    3.2.2 发酵条件的优化  51-56
      3.2.2.1 菌丝接种与孢子接种的比较  51-52
      3.2.2.2 培养基含水量  52
      3.2.2.3 培养温度  52-53
      3.2.2.4 培养基初始pH值  53-54
      3.2.2.5 麸皮的用量  54-55
      3.2.2.6 浅盘发酵生产纤维二糖酶的进程  55
      3.2.2.7 重复分批发酵试验  55-56
    3.2.3 纤维二糖酶的固定化  56-57
      3.2.3.1 孢子中的纤维二糖酶  56-57
      3.2.3.2 纤维二糖酶的固定化  57
    3.2.4 固定化纤维二糖酶的性质  57-59
      3.2.4.1 固定化酶的稳定性  57
      3.2.4.2 酶的耐热性  57-58
      3.2.4.3 酶反应的适宜pH值  58-59
      3.2.4.4 酶反应动力学常数  59
    3.2.5 固定化纤维二糖酶的催化试验  59-61
      3.2.5.1 重复分批酶解纤维二糖  59
      3.2.5.2 连续酶解纤维二糖  59-61
  3.3 小结  61-62
第四章 纤维原料的酶解工程  62-75
  4.1 材料与方法  62-65
    4.1.1 纤维原料及预处理  62
    4.1.2 酶制剂  62
    4.1.3 纤维原料水解液的制备  62-63
    4.1.4 批式酶解反应  63
    4.1.5 协同酶解反应  63-64
    4.1.6 纤维物料成分测定  64
    4.1.7 常用试剂及配制  64-65
  4.2 结果与讨论  65-74
    4.2.1 酶解工艺参数的优化  65-69
      4.2.1.1 不同底物对酶解效率的影响  65
      4.2.1.2 底物浓度  65-66
      4.2.1.3 酶用量  66-67
      4.2.1.4 酶解过程中产物的变化趋势  67-68
      4.2.1.5 酶系组成对纤维原料糖化的影响  68-69
    4.2.2 固定化纤维二糖酶在纤维原料酶水解中的应用  69-71
      4.2.2.1 固定化纤维二糖酶对纤维原料水解液的糖化作用  69
      4.2.2.2 重复分批糖化试验  69
      4.2.2.3 连续糖化试验  69-71
    4.2.3 里氏木霉纤维素酶与固定化纤维二糖酶的协同降解作用  71-74
      4.2.3.1 协同酶解反应进程  71-73
      4.2.3.2 分批添料式协同酶解试验  73-74
  4.3 小结  74-75
第五章 固定化乳酸杆菌发酵纤维原料水解液  75-85
  5.1 材料与方法  75-79
    5.1.1 菌种及保藏  75
    5.1.2 纤维原料水解液的制备  75
    5.1.3 麸皮水解液的制备  75
    5.1.4 培养基  75-76
    5.1.5 乳酸杆菌的固定化  76
    5.1.6 固定化乳酸杆菌发酵试验  76-77
    5.1.7 乳酸测定  77-78
    5.1.8 常用试剂及配制  78-79
  5.2 结果与讨论  79-84
    5.2.1 固定化细胞与游离细胞发酵性能的比较  79
    5.2.2 固定化细胞发酵纤维原料水解液  79-80
    5.2.3 温度的影响  80-81
    5.2.4 氮源的影响  81-82
    5.2.5 麸皮水解液对乳酸发酵的促进作用  82
    5.2.6 重复分批发酵试验  82-83
    5.2.7 连续发酵试验  83-84
  5.3 小结  84-85
第六章 利用串联式生物反应器转化纤维原料生成乳酸  85-94
  6.1 材料与方法  85-88
    6.1.1 纤维原料  85
    6.1.2 二级串联式生物反应器  85-86
    6.1.3 三级串联式生物反应器  86
    6.1.4 分批添料式协同酶解发酵  86-88
  6.2 结果与讨论  88-93
    6.2.1 纤维原料酶水解与固定化细胞发酵乳酸的耦联效应  88
    6.2.2 纤维二糖酶在耦联反应过程中的促进作用  88-90
    6.2.3 利用三级串联式生物反应器协同酶解发酵乳酸  90-91
    6.2.4 串联式生物反应器的稳定性研究  91
    6.2.5 分批添料式协同酶解发酵试验  91-93
  6.3 小结  93-94
第七章 利用共固定化体系协同转化纤维原料生成乳酸  94-102
  7.1 材料与方法  94-96
    7.1.1 共固定化体系的构建  94
    7.1.2 共固定化体系转化纤维原料水解液  94
    7.1.3 利用共固定化体系组建串联式生物反应器  94-95
    7.1.4 分批添料式协同酶解发酵  95-96
  7.2 结果与讨论  96-101
    7.2.1 共固定化体系的构建  96
    7.2.2 共固定化体系转化纤维原料水解液生成乳酸的进程  96-97
    7.2.3 串联式生物反应器中的协同酶解发酵  97-98
    7.2.4 串联式生物反应器的稳定性研究  98-99
    7.2.5 分批添料式协同酶解发酵乳酸  99-101
  7.3 小结  101-102
第八章 纤维素酶基因的克隆与表达  102-118
  8.1 材料与方法  102-113
    8.1.1 质粒与菌株  102
    8.1.2 培养基  102-104
    8.1.3 质粒DNA的提取与纯化  104-105
    8.1.4 DNA片断的凝胶电泳  105-106
    8.1.5 质粒DNA的酶切  106
    8.1.6 DNA酶切片段的回收  106-107
    8.1.7 DNA片段的连接  107-108
    8.1.8 重组DNA的转化  108
    8.1.9 PCR扩增法筛选含E_5基因的转化子  108-110
    8.1.10 含E_5基因转化子的平板筛选  110
    8.1.11 重组大肠杆菌摇瓶产酶试验  110
    8.1.12 常用试剂及配制  110-113
  8.2 结果与讨论  113-117
    8.2.1 纤维素酶E_5基因的扩增与分离  113
    8.2.2 E_5基因的体外重组  113
    8.2.3 重组质粒的转化  113-114
    8.2.4 重组质粒的筛选和鉴定  114-115
    8.2.5 纤维素酶E_5基因的表达  115-117
      8.2.5.1 平板培养试验  115
      8.2.5.2 摇瓶产酶试验  115-117
  8.3 小结  117-118
第九章 结论  118-120
参考文献  120-126
附录  126-127
致谢  127

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸
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