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可溶性单链抗体的GST活性研究及含有硒代半胱氨酸的单链抗体在大肠杆菌中的表达
作 者: 张鲲
导 师: 罗贵民
学 校: 吉林大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 硒代半胱氨酸 GST活性 肠杆菌 底物结合 目的蛋白 可溶性 硒蛋白 scFv 单链 谷胱甘肽
分类号: Q55
类 型: 博士论文
年 份: 2004年
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内容摘要
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酶，是大自然所创造出来的一种奇妙的生物大分子。它在催化反应过程中所表现出来的独特性质，即较快的反应速度、高效的转化率、特异的底物专一性、高度的反应选择性以及接近中性的反应pH和温和的反应温度，吸引了众多科学家的目光。生物化学家始终希望能够发现酶发挥功能的秘密，创造出具有酶催化性质的物质。 在不断深入广泛的研究中，人们发现酶催化的基石是底物结合和分子内催化。酶在发挥催化功能的过程中，首先识别和结合底物，从而实现分子内催化，使酶底复合物转换成酶过渡态复合物。因此底物结合部位对于酶催化来说是十分重要的。利用化学和生物学的方法和原理，并结合以往的实验结果，我们在进行酶的模拟方面采取的策略是：首先产生一个具有底物结合位点的受体，然后将催化基团引入受体的底物结合部位附近，从而获得具有酶催化活性的分子。利用单克隆抗体制备技术是获得具有底物结合部位蛋白质分子的常规方法，因此，只要抗体分子底物结合部位附近的适当位置具有相应的催化基团，则该抗体分子就可能表现出酶的活性。 自上世纪九十年代开始，我们科研小组就用谷胱甘肽衍生物免疫小鼠，利用单克隆抗体技术得到了一系列的具有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体。最近，我们又将其中的一株2F3的重链可变区和轻链可变区克隆到大肠杆菌中，表达得到了一个新的单链抗体scFv2F3。因此根据我们的预想，这些抗体都可能具有或者通过改造后可能具有以谷胱甘肽作为底物的酶的活力。中文摘要 可溶性单链抗体的GST活性研究 由于包涵体形式表达的单链抗体是没有生物学活性的，需要在体外进行 重折叠。因此，我们选用了能够表达可溶性单链杭体的工程菌Ro se一2F3. 表达的目的蛋白质部分存在于细胞裂解液的上清中，利用目的蛋白C一末 端含有His6一Tag的性质，用NiZ冷属离子鳌合层析柱对其进行初步纯化，再用 高效液相对其进行进一步纯化。利用Westem Blot对所得蛋白质进行了鉴定， 证明所得到的蛋白质是目的蛋白scFvZF3，从而得到了可溶性的单链杭体 seFvZF3。 谷耽甘肤硫转移酶(GST)是以谷砒甘肤作为底物的酶类之一。它是细爵胞内解毒酶家族，催化谷耽甘肤与诸多内源性和外源性的亲电物质反应。尽 管所有的G ST都具有相似的三级结构和活性中心拓扑学，但是它们的催化基 团却显著不同，分为琳，ser和cys三种。在单链杭体scFvZF3分子中，存 在着许多Tyr、ser和Cys残基，特别是在CDRs区存在的Tyr、ser或cys残 基可能在空间上与谷耽甘肤的疏基接近，对催化反应的发生具有特殊的意义。 我们测定了可溶性单链杭体scFvZF3对多种亲电物质的催化活性，发现 它的GST(CDNB)活力为0.997 LJ/mg，GST(ETHA)活力为0.109 U/mg，GsT(对 硝基澳匆活力为3.646U加宕，GsT(C u0o均活力为0.928U加g。结果表明， 单链杭体scFvZF3具有GST活力，并由于它对e型GST的特征性底物表现出 催化活性.同时根据化学修饰scFvZF3中Ser后，scFvZF3丧失GST活性的 实验结果，推断出单链杭体scFvZF3具有GST催化能力的基团是Ser。 另外，我们还以CDNB为底物对单链杭体scFvZF3 GST活性进行了研究。 结果表明单链杭体scFvZF3 GsT活力的最适温度为44℃，最适pH值为pH 7.9。 动力学研究结果表明，单链杭体scFvZF3 GST活性催化反应机制遵循依次反应 机制或随机反应机制，它对两种底物的K五1都很低，但Kal值很小。这可能是由 于诱导单链杭体scFvZF3产生的谷耽甘肤衍生物结构与反应产物的结构非常 相似造成的，导致产物不能有效释放而延迟了反应的进行. 单链杭体scFvZF3表现出了GST活力不仅说明了杭体分子底物结合部位 的适当位置具有GST的催化基团Ser，还证实了我们最初的预想。这为我们 所进行酶模拟的策略提供了一个新的佐证。吉林大学博士论文张鳃含有硒代半脱氛酸的单链杭体在大肠杆菌中的表达 谷耽甘肤过氧化物酶(GPX)也是以谷耽甘肤作为底物的酶类之一它是生物机体内重要的杭氧化酶之一，在细胞、血液级组织中广发分布。它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断氧自由基对集体的进一步损伤，从而保证细胞及组织正常生理功能的发挥。有些疾病如白内障、糖尿病、克山病及心血管疾病等发生时，机体内的GPX水平降低，导致自由基代谢紊乱。因此，GPX作为杭氧化药物有其重要的地位。但由于GPX在机体内的含量较低、稳定性差，不利于大规模制备及应用.因此科学家们将目光转向了GPX模拟物的研究。 硒代半耽氛酸(See)是GPX催化必需基团，被认为是第二十一种氨基酸。由于编码Sec的三联体密码子是通常作为终止子的UGA，而在所有已知能表达硒蛋白的组织中，uGA仍然保持其正常功能，因此，se。的掺入需要一特殊的调控机制。 硒代半耽氨酸的掺入机制十分复杂。在原核生物中，涉及到一个顺式作用元件和四个基因产物。顺式作用元件是位于mRNA密码子UGA3’端的一个特殊的茎一环结构，称为硒代半耽氛酸插入元件(selenoey
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全文目录
第一篇 可溶性单链抗体的GST活性研究 15-46
第一章 前言 15-17
第二章 可溶性单链抗体的制备 17-28
第一节 序言 17-18
第二节 可溶性单链抗体的表达及其分离纯化 18-27
一 实验材料 18-20
1.1 主要试剂 18
1.2 实验仪器 18-19
1.3 主要溶液的配制 19-20
二 实验方法 20-22
2.1 单链抗体的诱导表达 20
2.2 单链抗体的分离纯化 20-21
2.3 单链抗体的鉴定 21-22
三 结果分析 22-25
3.1 单链抗体的诱导表达 22
3.2 单链抗体的分离纯化 22-24
3.3 单链抗体的鉴定 24-25
四 讨论 25-27
本章小结 27-28
第三章 可溶性单链抗体的GST活性研究 28-40
第一节 序言 28-29
第二节 可溶性单链抗体的GST活性研究 29-40
一 实验材料 29
1.1 主要试剂 29
1.2 实验仪器 29
二 实验方法 29-31
2.1 结合常数的测定 29-30
2.2 GST活力的测定 30-31
2.3 scFv2F3的化学修饰 31
2.4 蛋白质含量测定 31
2.5 最适温度和最适pH值的测定 31
2.6 动力学常数的测定 31
三 结果与讨论 31-40
3.1 结合常数的测定 32-33
3.2 单链抗体scFv2F3的GST活力 33-37
3.3 最适温度和最适pH值 37
3.4 scFv 2F3的动力学分析 37-40
本章小结 40
参考文献 40-46
第二篇 含有硒代半胱氨酸的单链抗体在大肠杆菌中的表达 46-108
第一章 前言 46-50
第二章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体在E.coli中的表达 50-81
第一节 序言 50-51
第二节 目的基因在表达载体pET21a(+)中的构建 51-70
一 实验材料 51-52
1.1 主要试剂 51
1.2 菌株与质粒 51
1.3 培养基及缓冲液 51-52
1.4 主要仪器 52
二 实验方法 52-55
2.1 质粒的提取 52
2.2 目的基因的获得 52-53
2.3 琼脂糖凝胶电泳 53
2.4 目的片段的回收 53
2.5 限制性内切酶消化DNA 53-54
2.6 酶切产物的连接 54
2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 54-55
2.8 连接产物的转化 55
2.9 阳性克隆的筛选及其鉴定 55
2.10 重组质粒及其菌种的保存 55
三 结果分析 55-67
3.1 重组质粒pEF的构建 55-63
3.1.1 目的基因片段EF的扩增 55-56
3.1.2 PCR产物的酶切鉴定 56-57
3.1.3 载体pET21a(+)的酶切鉴定 57-59
3.1.4 载体和目的基因的双酶切 59-60
3.1.5 连接反应 60
3.1.6 阳性克隆的筛选 60-63
3.2 重组质粒pEFS的构建 63-65
3.2.1 目的基因片段EFS的扩增 63-65
3.2.2 阳性克隆的筛选 65
3.3 重组质粒pEFT和pEFTS的构建 65-67
3.3.1 目的基因片段EFT和EFTS的扩增 65-66
3.3.2 阳性克隆的筛选 66-67
四 讨论 67-70
4.1 突变位点的选择 67-68
4.2 利用聚合酶链式反应技术获得目的基因 68-70
第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体基因的表达 70-80
一 实验材料 70
1.1 主要试剂 70
1.2 实验仪器 70
1.3 主要溶液的配制 70
二 实验方法 70-74
2.1 转化 70-71
2.2 工程菌的诱导表达 71-73
2.2.1 工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 71
2.2.2 菌株BL21(DE3)-pEFS／pSU、BL21(DE3)-pEF／pSU和BL21(DE3)-pE／pSU的诱导表达 71-72
2.2.3 菌株BL21(DE3)-pEFT／pSU和BL21(DE3)-pEFTS／pSU的诱导表达 72-73
2.3 表达产物的鉴定 73
2.3.1 蛋白质免疫印迹 73
2.3.2 ~(75)Se放射性自显影 73
2.4 工程菌BL21(DE3)-pE／pSU系列表达产物的分离纯化 73-74
三 结果与讨论 74-80
3.1 工程菌BL21(DE3)-pEF和BL21(DE3)-pEFS诱导表达的结果 74-75
3.2 工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 75-76
3.3 工程菌BL21(DE3)-pE／pSU系列诱导表达产物的Western Blot鉴定 76-77
3.4 pE系列质粒与pSU质粒的共转化 77-79
3.5 ~(75)Se放射性自显影鉴定表达产物 79-80
3.6 工程菌BL21(DE3)-pEFTS／pSU表达产物的分离纯化 80
本章小结 80-81
第三章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 81-93
第一节 序言 81-82
第二节 目的基因在表达载体pGEX-2T中的构建 82-87
一 实验材料 82-83
二 实验方法 83
三 结果分析 83-87
3.1 目的基因片段GF、GFS、GFT和GFTS的扩增 83
3.2 PCR产物的酶切鉴定 83-85
3.3 阳性克隆的筛选 85-87
第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 87-92
一 实验材料 87
二 实验方法 87-88
2.1 pG系列质粒与pSU质粒的共转化 87
2.2 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列的诱导表达 87
2.3 表达产物的鉴定 87
2.4 工程菌BL21(DE3)pG／pSU系列表达产物的分离纯化 87-88
三 结果与讨论 88-92
3.1 pG系列质粒与pSU质粒的共转化 88
3.2 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列的诱导表达 88-89
3.3 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列表达产物的~(75)Se放射性自显影鉴定 89-90
3.4 工程菌BL21(DE3)-pGFTS／pSU表达产物的分离纯化 90-92
本章小结 92-93
第四章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与信号肽的融合表达 93-105
第一节 序言 93-94
第二节 目的基因在表达载体pPelB中的构建 94-98
一 实验材料 94
二 实验方法 94
三 结果分析 94-98
3.1 目的基因片段PFT、PFS和PFTS的扩增 94-95
3.2 PCR产物的酶切鉴定 95-96
3.3 阳性克隆的筛选 96-98
第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与信号肽的融合表达 98-104
一 实验材料 98
1.1 主要试剂 98
1.2 实验仪器 98
1.3 主要溶液的配制 98
二 实验方法 98-99
2.1 pPFTS质粒与pSU质粒的共转化 98
2.2 工程菌BL21(DE3)-pP系列的诱导表达 98
2.3 表达产物的鉴定 98
2.4 工程菌BL21(DE3)-pPFTS／pSU系列表达产物的分离纯化 98-99
2.4.1 包涵体的收集及洗涤 98-99
2.4.2 电洗脱法收集目的蛋白 99
三 结果与讨论 99-104
3.1 pPFTS质粒与pSU质粒的共转化 99-100
3.2 工程菌BL21(DE3)-pP系列的诱导表达 100-101
3.3 含有硒代半胱氨酸的单链抗体的分离纯化 101-102
3.4 目的蛋白产物的鉴定 102-104
3.5 电洗脱法收集目的蛋白 104
本章小结 104-105
参考文献 105-108
第三篇 文献综述 108-177
第一章 酶模拟的理论基础 108-111
参考文献 110-111
第二章 抗体酶 111-118
一 抗体酶的诞生 111-112
二 抗体酶的制备 112-113
三 抗体酶涉及的领域 113-115
四 抗体酶存在的问题及可能的对策 115-116
五 抗体酶的应用前景 116-117
参考文献 117-118
第三章 谷胱甘肽硫转移酶的结构功能与分类 118-136
一 GST的解毒作用 118-120
二 GST的晶体结构 120-124
三 哺乳动物的GST的分类标准 124-128
3.1 Alpha、Mu、Pi类GST 126
3.2 Theta类GST 126-127
3.3 Kappa类GST 127
3.4 Omega类GST 127-128
四 非哺乳动物GST 128-129
4.1 Sigma类GST 128
4.2 Zeta类GST 128-129
4.3 Beta类GST 129
五 真菌类GST 129-130
六 植物类GST--Phi和Tau类GST 130
七 昆虫GST--类型Ⅰ和类型Ⅱ 130-131
八 蠕虫GST 131
九 GST分类的进化意义 131-132
参考文献 132-136
第四章 谷胱甘肽过氧化物酶的结构与功能 136-141
一 GPX的生物学作用 136-137
二. GPX的结构 137-139
2.1 牛cGPX的二级结构 137
2.2 牛cGPX活性中心的结构 137-138
2.3 人pGPX的活性中心结构 138-139
参考文献 139-141
第五章 硒代半胱氨酸的生物合成 141-150
一 硒代半胱氨酸表达机制 141-143
二 原核生物的硒代半胱氨酸插入元件 143-144
三 真核生物的SECIS 144-146
四 硒蛋白的原核表达 146
参考文献 146-150
第六章 外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略 150-177
一 高效表达载体的构建 150-153
二 转录调控 153-157
2.1 启动子 153-155
2.2 转录终止子 155
2.3 抗终止子 155-156
2.4 严谨调控表达系统 156-157
三 翻译调控 157-159
3.1 mRNA翻译起始 157-158
3.2 翻译起始增强子 158
3.3 mRNA的稳定性 158-159
3.4 翻译终止 159
四 蛋白质定位 159-165
4.1 在细胞质中表达 160-161
4.2 在周质腔中表达 161-162
4.3 细胞外分泌表达 162-165
五 以融合蛋白形式表达 165-169
六 分子伴侣的作用 169
七 密码子的使用 169-170
八 蛋白质的降解 170-172
九 发酵条件 172
参考文献 172-177
作者简历 177-179
致谢 179-181
中文摘要 181-185
ABSTRACT 185-189
附录一 载体pET-21a(+)图谱#A 189-191
附录二 载体pPelB图谱#C 191-193
附录三 单链抗体scFv2F3基因序列及其氨基酸序列#E 193-195
附录四 单链抗体2F3及其突变体基因序列和氨基酸序列#G 195-196
附录五 单链抗体2F3及其突变体氨基酸序列#H 196-197
附录六 测序结果 197-202
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