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白斑综合症病毒致病相关早期蛋白的鉴定及基因组同源重复区的功能研究

作　者: 李嵚
导　师: 陈英杰；杨丰；张景海
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药学
关键词: 对虾白斑综合症病毒 胶原蛋白 胸腺嘧啶核苷酸合成酶 DNA结合蛋白 功能基因 克隆表达
分类号: S945
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndromic Virus, WSSV)，又称为白斑杆状病毒(White Spot Bacilliform Virus, WSBV)，是严重危害对虾养殖业的主要病原之一。本论文从WSSV宿主广泛性出发，围绕着病毒致病关键蛋白，特别是病毒早期蛋白，以及病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用机制，从结构功能基因组学和蛋白质组学角度对该病毒快速致死性的原因和机制进行了深入的研究。 本文内容主要包括下列工作：(1)以卤虫(Artemia franciscana)为实验对象简单阐述了其在WSSV宿主链中的作用；(2)在WSSV感染过程中起关键作用的病毒早期蛋白，如：病毒类胶原蛋白(Collagen-like Protein，CLP)和胸腺嘧啶核苷酸合成酶(Thymidylate Synthase，TS)的结构功能作了深入的研究；(3)通过病毒基因组同源重复区特异性结合蛋白的纯化鉴定，对病毒早期基因表达产物与宿主蛋白间的相互作用和在病毒感染和复制过程的作用做了初步的分析。 实验结果显示：□卤虫是一种acute host和latent host之外的，非致病性的载体宿主(passive carrier)，病毒进入宿主体内并不增殖，宿主无大量死亡和其他典型的病理特征，病毒染色体DNA可随着宿主繁殖而传递到受精卵中，并随着子代个体的发育成熟逐渐消失；□作为一种双链DNA动物病毒，在WSSV中发现了独特的类胶原蛋白(WSSV-CLP)和高保守的病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶(WSSV-TS)，这两种蛋白在病毒感染宿主早期开始转录表达，其中WSSV-clp基因编码一个病毒糖蛋白，该蛋白位于病毒粒子核衣壳和病毒包膜之间，并可形成多聚体结构。WSSV-CLP是第一个被证实糖基化修饰的结构蛋白。WSSV-ts基因编码表达WSSV基因组中最为保守的一个蛋白，体外表达的重组TS具有特异的底物结合能力。虽沈阳药科大学博士学位论文摘要然没有明显的poly(A)加尾信号(AATAAA)，3‘一RAcE发现该基因在病毒感染过程中可以正常转录，其mRNA含有poly(A)尾巴;口通过改进的亲和层析技术，SDS一PAGE电泳及GMSA分析等手段的相互结合，纯化得到特异结合于病毒同源区(homologous repeat regions，hrrs)高保守结构域(highly eonserved domain，HCD)的一组蛋白。这些蛋白与病毒感染宿主，并启动宿主已封闭基因的重新表达，及病毒复制增殖相关的信号传导系统有关。 结果表明，WSSV一CLP是病毒结构蛋白，该蛋白经过糖基化修饰，可能在病毒感染宿主细胞，与宿主细胞表面受体结合，并促进宿主细胞膜融合的过程中起重要的作用。包括病毒胸腺嗜睫核昔酸合成酶在内的一系列由病毒早期基因编码表达的，与DNA代谢密切相关的酶组成的独立于宿主之外的病毒胸腺啼睫核昔酸合成系统，可能是WSSV感染宿主导致快速死亡的主要原因之一。病毒人尹脚特异性结合蛋白的发现，将为研究病毒核酸复制，表达调控提供了大量的信息。

全文目录


摘要  8-12
前言  12-19
第1章 卤虫在对虾白斑综合症病毒传播感染中的作用  19-29
  概述  20-21
  1 前言  21-23
    1.1 对虾白斑综合症病毒的宿主广泛性概述  21-22
    1.2 卤虫感染白斑综合症病毒研究的目的和意义  22-23
  2 材料与方法  23-25
    2.1 材料  23
    2.2 方法  23-25
      2.2.1 卤虫的饲养  23-24
      2.2.2 卤虫的人工感染  24-25
      2.2.3 白斑综合症病毒的检测  25
  3 结果与讨论  25-29
    3.1 卤虫投喂病毒感染死亡率统计  25-27
    3.2 白斑综合症病毒在卤虫中的横向和纵向传播  27-29
第2章 对虾白斑综合症病毒胶原蛋白的鉴定  29-56
  概述  30-31
  1 前言  31-38
    1.1 胶原蛋白概述  31-35
      1.1.1 胶原蛋白的种类  32-34
      1.1.2 胶原蛋白的结构和生物学功能特点  34-35
    1.2 类胶原蛋白  35-36
      1.2.1 类胶原蛋白定义  35
      1.2.2 类胶原蛋白在结构和功能上与胶原蛋白的差别  35-36
    1.3 类胶原片段  36
      1.3.1 类胶原片段定义  36
      1.3.2 类胶原片段的功能及存在范围  36
    1.4 病毒膜蛋白  36-38
      1.4.1 结构性质和主要功能域  37-38
      1.4.2 病毒膜蛋白与某些胶原蛋白在结构上的相似性  38
  2 材料与方法  38-43
    2.1 材料  38-39
    2.2 引物  39
    2.3 方法  39-43
      2.3.1 螯虾感染  39
      2.3.2 感染螯虾总mRNA的提取  39
      2.3.3 感染螯虾总RNA的提取  39
      2.3.4 白斑综合症病毒类胶原蛋白结构的计算机辅助分析  39-40
      2.3.5 RT-PCR  40
      2.3.6 Northern blot  40
      2.3.7 类胶原蛋白基因在大肠杆菌(E.coli.)中的克隆表达  40
      2.3.8 核衣壳病毒和有包膜病毒的纯化分离  40
      2.3.9 抗体IgG制备  40-41
      2.3.10 Western blot  41
      2.3.11 特异抗体制备及免疫定位技术  41-42
      2.3.12 免疫亲和层析柱纯化天然病毒类胶原蛋白  42-43
      2.3.13 病毒类胶原蛋白糖基化特点分析  43
  3 结果与讨论  43-56
    3.1 白斑综合症病毒类胶原蛋白一级结构分析  43-46
    3.2 白斑综合症病毒类胶原蛋白基因转录水平分析  46-49
    3.3 白斑综合症病毒类胶原蛋白N末端肽的表达纯化  49-52
    3.4 抗体制备  52
    3.5 白斑综合症病毒类胶原蛋白的免疫定位  52-53
    3.6 天然病毒CLP蛋白的免疫亲和纯化和糖基化分析  53-56
第3章 对虾白斑综合症病毒中胸腺嘧啶核苷酸合成酶的鉴定  56-73
  概述  57-58
  1 前言  58-63
    1.1 胸腺嘧啶核苷酸合成酶概述  58-63
      1.1.1 胸腺嘧啶核苷酸合成酶的生物学功能  59-60
      1.1.2 胸腺嘧啶核苷酸合成酶在抗肿瘤研究中的应用  60-61
      1.1.3 胸腺嘧啶核苷酸合成酶的主要功能域  61-63
    1.2 胸腺嘧啶核苷酸合成酶研究现状及展望  63
  2 材料与方法  63-65
    2.1 材料  63-64
    2.2 引物  64
    2.3 方法  64-65
      2.3.1 计算机辅助分析  64
      2.3.2 RT-PCR  64
      2.3.3 5＇／3′-RACE  64
      2.3.4 白斑综合症病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶的克隆表达  64
      2.3.５ TS底物结合性质的鉴定  64-65
  3 结果与讨论  65-73
    3.1 白斑综合症病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶的一级结构  65-66
    3.2 白斑综合症病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶进化树分析  66-69
    3.3 白斑综合症病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因转录水平分析  69-70
    3.4 白斑综合症病毒胸腺嘧啶核苷酸合成酶底物结合实验  70-73
第4章 病毒同源重复区特异DNA结合蛋白的纯化鉴定  73-95
  概述  74-76
  1 前言  76-83
    1.1 白斑综合症病毒基因组内多拷贝重复片段  76-78
      1.1.1 基因组DNA序列重复性特征  76
      1.1.2 白斑综合症病毒中重复序列特征  76-78
    1.2 DNA结合蛋白  78-79
    1.3 特异性DNA结合蛋白的纯化  79-83
      1.3.1 经典亲和层析法  79-81
      1.3.2 改进的亲和层析纯化技术  81-82
      1.3.3 凝胶迁移率分析  82-83
  2 材料与方法  83-86
    2.1 引物  83
    2.2 溶液配制  83-84
    2.3 方法  84-86
      2.3.1 探针灵敏度检测  84
      2.3.2 蛋白探针结合反应  84
      2.3.3 分子筛CM-sepharose 6B分离纯化酶切产物小片段  84-85
      2.3.4 蛋白粗提物(Crude Extracts)样品的制备  85
      2.3.5 亲和层析法纯化特异DNA结合蛋白  85-86
      2.3.6 结合蛋白凝胶迁移率分析  86
  3 结果与讨论  86-95
    3.1 病毒基因组重复序列计算机辅助分析  86-87
    3.2 亲和层析配体的制备  87-88
      3.2.1 含HCD-158片段的克隆  87-88
      3.2.2 分子筛纯化亲和配体  88
    3.3 亲和层析蛋白样品的选择  88-89
    3.4 亲和层析纯化特异DNA结合蛋白  89-91
    3.5 凝胶阻滞反应鉴定纯化的特异性DNA结合蛋白  91-94
      3.5.1 GMSA分析  91-92
      3.5.2 健康虾与感染虾亲和纯化洗脱产物比较  92-93
      3.5.3 特异性结合位点的确定  93-94
    3.6 肽指纹图谱分析  94-95
全文结论与展望  95-97
参考文献  97-107
附录  107-117
  附录1. 常规实验方法  107-113
  附录2. 常规试剂和溶液  113-117
博士在学期间发表与待发表文章  117-118
致谢  118

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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