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可跨膜MnSOD融合蛋白的克隆表达及功能研究

作　者: 程安阳
导　师: 范立强
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Mn-SOD 蛋白转导肽 基因克隆 表达 穿膜 抗肿瘤 抗辐射
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


超氧化物歧化酶是自由基清除剂,能预防并保护活性氧自由基对人体和细胞产生的破坏和损害,具有抗炎,抗辐射,抗肿瘤等作用。鉴于SOD是生物大分子,很难跨过细胞膜发挥生物学效应,本课题选择TAT和R9两种跨膜转导肽,通过PCR将其编码基因与锰超氧化物岐化酶(Mn-SOD)基因连接,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达重组蛋白；利用细胞实验比较并验证了重组Mn-SOD、Mn-SOD-TAT、Mn-SOD-R9和Mn-SOD-EC-SOD的跨膜效应与抑癌、抗辐射能力。论文分三部分：首先,人工合成含有Mn-SOD与转导肽TAT和R9序列的引物,以质粒pET24-MnSOD为模板,PCR扩增Mn-SOD-TAT和Mn-SOD-R9融合基因；扩增产物与载体pET28a(+)连接构建重组表达质粒pET28a-MnSOD-TAT和pET28a-MnSOD-R9;重组质粒转入宿主菌E. coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白,37℃表达,表达量占菌体总蛋白的40%左右,主要以不溶的包涵体形式存在。接着,通过改变诱导表达温度,诱导剂浓度和锰离子浓度等优化了重组融合蛋白的表达条件,并探索了重组融合蛋白的纯化条件。MnSOD-TAT的最优表达条件为28℃终浓度0.2mmol/L的IPTG和0.6mol/L Mn2+下诱导表达12小时,此时可溶性上清中Mn-SOD活力约500U/ml;MnSOD-R9的最优表达条件为25℃终浓度0.4mmol/L的IPTG和0.6mol/L Mn2+下诱导表达12小时,此时可溶性上清中Mn-SOD活力约700U/ml。常规条件下可溶性融合蛋白不能与Ni柱良好的结合,在上柱缓冲液中加入2M尿素后,重组融合蛋白能较好的用Ni柱亲和纯化,产物纯度均高于90%。最后,将荧光素FITC与四种重组Mn-SOD偶联验证重组蛋白的可跨膜性；利用MTT法检测重组融合蛋白对癌细胞增殖、紫外辐射和过氧化氢损伤的影响。Mn-SOD-TAT、Mn-SOD-R9和Mn-SOD-EC-SOD均较Mn-SOD更易进入细胞,更好的发挥抑制癌细胞增殖、降低紫外辐射和过氧化氢对细胞的损伤效应,穿膜与其它生物效应与重组蛋白的浓度和作用时间有关；含不同穿膜肽的Mn-SOD在抑制癌细胞增殖、抗辐射和抗过氧化氢方面各有优势。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
第一章 绪论  9-25
  1.1 超氧化物歧化酶简介  9-13
    1.1.1 SOD的发现  9
    1.1.2 SODs的分类以及结构  9-13
  1.2 SOD的药理和毒理活性  13-17
    1.2.1 SOD的防辐射作用  14
    1.2.2 SOD与糖尿病的慢性并发症  14-15
    1.2.3 SOD与肺病  15
    1.2.4 SOD的抗炎作用  15-16
    1.2.5 SOD对肿瘤的作用  16
    1.2.6 SOD的其他药理活性  16-17
    1.2.7 SOD的毒理研究  17
  1.3 SOD的应用和研究进展  17-18
    1.3.1 药用SOD的应用和研究进展  17-18
    1.3.2 SOD在工业上的应用  18
  1.4 MnSOD  18-22
    1.4.1 分子生物学特性  19
    1.4.2 人MnSOD基因特征  19-20
    1.4.3 MnSOD基因的多态性  20
    1.4.4 MnSOD的表达调控  20-21
    1.4.5 MnSOD基因的克隆表达  21-22
  1.5 蛋白转导域  22-23
  1.6 可跨膜的SOD研究现状  23-24
  1.7 实验流程和路线  24-25
第二章 可跨膜MnSOD的构建及表达  25-35
  1. 前言  25
  2. 材料与仪器  25-26
  3. 实验方法  26-30
    3.1 目的基因的扩增  27
    3.2 PCR扩增产物的回收(见割胶回收试剂盒)  27-28
    3.3 克隆质粒的构建  28
    3.4 质粒转化  28
    3.5 质粒的抽提见质粒抽提试剂盒  28-29
    3.6 感受态细胞的制备  29
    3.7 表达菌株的构建  29-30
    3.8 可跨膜SOD的表达  30
  4. 实验结果与讨论  30-34
  5 小结  34-35
第三章 可跨膜MnSOD的表达优化与纯化  35-46
  1 前言  35
  2 材料  35
  3 方法  35-38
    3.1 融合蛋白的表达优化  35-36
    3.2 融合蛋白的分离纯化  36-37
    3.3 分析方法  37-38
  4 结果与讨论  38-45
  5 小结  45-46
第四章 MnSOD融合蛋白的跨膜及抑癌作用研究  46-52
  1. 前言  46
  2. 材料  46
  3. 方法  46-48
  4. 结果与讨论  48-51
    4.1 FITC-rhSOD的跨膜实验  48-49
    4.2 MTT法检测细胞增殖  49-51
  5. 小结  51-52
第五章 MnSOD融合蛋白的紫外保护与抗过氧化氢效应  52-58
  1. 前言  52
  2. 材料  52
  3. 方法  52-54
    3.1 融合蛋白的紫外保护作用  52-53
    3.2 紫外辐射后对细胞的损伤  53
    3.3 融合蛋白的抗过氧化氢能力  53-54
  4. 结果分析  54-57
    4.1 融合蛋白的紫外保护作用  54-55
    4.2 紫外辐射对细胞的损失  55
    4.3 融合蛋白的抗过氧化氢能力  55-57
  5. 小结  57-58
第六章 结论与展望  58-59
参考文献  59-63
致谢  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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