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牛IFN-α/γ基因的克隆、表达及重组蛋白的应用研究

作　者: 史喜菊
导　师: 汪明
学　校: 中国农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: BoIFN-α BoIFN-γ FMDV VP1 原核表达 酵母表达 免疫佐剂
分类号: S852.2
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


本研究通过PCR克隆了我国地方品种晋南黄牛、荷斯坦奶牛、福安水牛、富钟水牛、环湖型牦牛以及野牦牛的IFN-α基因，构建了原核表达质粒pQE30／BoIFN-α。测序结果表明，六个克隆片段全长均为498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与文献报道的BoIFN-α各亚型相比，只有荷斯坦奶牛IFN-α基因与BoIFN-αA亚型存在一个点变异，其余五个克隆均为BoIFN-α新亚型，建议命名为BoIFN-αD2、BoIFN-αI、BoIFN-αJ、BoIFN-αK和BoIFN-αL。pQE30／BoIFN-α在大肠杆菌JM109中表达出了一条分子量20kD的特异蛋白带，表达蛋白以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的25％。粗制rBoIFN-α在CEF/VSV和MDBK／VSV细胞系上的抗病毒活性分别为×105 U／mg和×106 U／mg，在MDBK细胞上对IBRV攻击有一定的抵抗力。这一结果表明BoIFN-α基因序列的变化并没有引起蛋白生物学活性改变，可能只与品种进化和地理分布有关。 从经Con A刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞中提取总RNA，通过RT-PCR克隆了BoFN-γcDNA全基因，与克隆载体T-Easy连接。测序结果表明，BoFN-γ cDNA全长501个核苷酸，编码166个氨基酸的前体蛋白，与GenBank中BoIFN-γ序列存在不同程度的点变异。亚克隆BoFN-γ成熟肽基因，分别构建原核表达菌株pET28a／BoIFN-γ／BL21（DE3）和毕赤酵母表达菌株pPICZα／BoIFN-γ／GS115。原核表达菌株在30℃和37℃均表达出18kD目的蛋白，37℃表达量占菌体总蛋白的37％，表达蛋白以包涵体形式存在；30℃表达量占菌体总蛋白的18％，但25％的表达蛋白以可溶形式存在于裂解上清中。BoFN-γ在酵母中实现了高效分泌表达，表达产物直接分泌到培养上清中，表达量高达1.0g／L。抗病毒活性试验表明，rBoIFN-γ（P.pastoris）在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的抗病毒活性分别达×105 U／mg和×106 U／mg，而rBoIFN-γ（E.coli）的抗病毒活性分别达×104 U／mg和×105 U／mg，统计学分析差异显著。 从PMD-18／VP1中亚克隆了FMDV抗原基因VP1，分别将VP1及VP1与BoIFN-γ在毕赤酵母中进行了表达与共表达。表达的VP1蛋白分子量为28kD，共表达蛋白BoIFN-γ／VP1分子量为52kD，表达产物直接分泌到培养上清中，表达量高达1.0g/L。 将毕赤酵母表达的rVP1、rBoIFN-γ和共表达rBoIFN-γ／VP1蛋白分别免疫小鼠，分别于每次免疫后2周采血、分离血清，ELISA测定血清抗体效价；末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞，用MTT法做T淋巴细胞增殖试验：通过半定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表达水平，试验结束前三天做迟发型超敏反应。小鼠免疫试验结果表明，毕赤酵母表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激免疫小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫反应；rBoIFN-γ具有很强的免疫佐剂效应，与VP1蛋白联用或BoIFN-γ/VP1共表达蛋白能显著增强小鼠的体液免疫和细胞免疫水平，血清IgG抗体水平显著升高，T细胞增殖反应显著增强，抗原特异性迟发型超敏反应（DTH）更强烈，Th1型和Th2型细胞因子表达量同时增高，而且共表达蛋白免疫效果优于联合免疫，各项免疫指标更高。

全文目录


插图和附表清单  9-12
缩略词表  12-14
文献综述  14-29
  文献综述一 牛干扰素研究进展  14-24
  文献综述二 分子免疫佐剂在口蹄疫基因工程疫苗中的应用  24-29
试验研究  29-122
  第一章 中国地方品种牛α干扰素(BoIFN-α)基因的克隆、表达及抗病毒活性研究  29-54
    1 引言  29-30
    2 材料与方法  30-41
    3 结果  41-51
    4 讨论  51-53
    5 小结  53-54
  第二章 荷斯坦奶牛γ干扰素(BOIFN-γ)基因的克隆和序列分析  54-65
    1 引言  54-55
    2 材料与方法  55-59
    3 结果  59-63
    4 讨论  63-64
    5 小结  64-65
  第三章 荷斯坦奶牛γ干扰素cDNA的原核表达及抗病毒活性分析  65-75
    1 引言  65-66
    2 材料与方法  66-69
    3 结果  69-72
    4 讨论  72-74
    5 小结  74-75
  第四章 荷斯坦奶牛IFN-γ毕赤酵母表达系统的建立  75-90
    1 引言  75-76
    2 材料与方法  76-81
    3 结果  81-87
    4 讨论  87-89
    5 小结  89-90
  第五章 口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及VP1与BoIFN-γ基因的共表达  90-105
    1 引言  90-91
    2 材料与方法  91-96
    3 结果  96-102
    4 讨论  102-104
    5 小结  104-105
  第六章 重组BoIFN-γ对口蹄疫基因工程疫苗免疫效果的研究  105-122
    1 引言  105-106
    2 材料与方法  106-110
    3 结果  110-119
    4 讨论  119-121
    5 小结  121-122
结论  122-123
参考文献  123-133
致谢  133-134
作者简介  134-136
附录  136-144

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜生理学、生物物理学、生物化学
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