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大肠杆菌VT噬菌体的特征及其受体研究

作　者: 严亚贤
导　师: 陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 大肠杆菌0157 VT2噬菌体溶源转换 vpr基因受体
分类号: S852.61
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

大肠杆菌O157：H7是一种致病力很强的肠道致病菌，主要引起人和动物的出血性肠炎、溶血性尿毒综合征而致较高的死亡率，已在全球范围内引起关注。尽管O157的高致病力的机制尚未完全明了，但已确定该菌的重要毒力因子之一是志贺毒素（Shiga toxin,ST），也称为Vero毒素（VT）。编码VT的基因位于噬菌体（VT噬菌体）的染色体上。VT噬菌体的毒粒特征、VT噬菌体是否进行毒力基因的水平转移、基因水平转移的条件、VT噬菌体的溶源转换与细菌毒力的相关性，均直接关系到病原菌的致病力。因此对VT噬菌体的研究，有助于对大肠杆菌O157：H7的预防、诊断和治疗。为掌握日常肉品中大肠杆菌O157的污染情况，本实验对超市和农贸市场的生牛肉进行大肠杆菌O157的调查。利用鉴别分离培养、形态特征观察，API 20E生化特性鉴定，玻片凝集试验、快速检测试剂盒等，对上海某地区5家超市及3个菜市场的生牛肉进行大肠杆菌O157的检测，并测定分离菌株对小鼠的致病力。结果从120份样本中检测出3株大肠杆菌O157：H7和2株大肠杆菌O157：NM。3株大肠杆菌O157：H7均能致死试验小鼠，表明超市、菜市场生牛肉中存在高致病力的大肠杆菌O157：H7的污染。高致病力的大肠杆菌O157的存在，提示与该菌相关的VT噬菌体的存在。本试验利用敏感指示菌MC1061，经双层琼脂法纯化和PCR扩增VT2基因，分别从大肠杆菌O157菌株、牛粪、鸡粪和污水中分离到了5株VT2噬菌体。这些噬菌体蚀斑透明，直径为0.5-2mm，对指示菌的感染效价均在10₉PFU／mL以上。电镜下可见头部为六边形、尾部短而硬。对氯仿和56℃30min抵抗。噬菌体分离株SHφW1感染MC1061后产生溶源菌（MC1061／SHφW1），经检测谊溶源菌具有VT2基因，而亲本MC1061中不含VT2基因。分离到VT2噬菌体的菌株及溶源菌株的滤液均对Vero细胞产生病变效应。表明环境中普遍存在含有VT2基因的噬菌体，VT2噬菌体通过溶源可将毒力基因水平传递，证实了VT2基因与细菌毒力的相关。大肠杆菌O157菌株、牛粪、鸡粪和污水中VT噬菌体的存在，造成了土壤的污染。本试验利用重组标记有Kan^r基因的VT噬菌体，壤土、粘土和砂土三种不同的土质建立了土壤模型，以检测土壤中噬菌体对土壤的吸附力以及在土壤中存活的差异，并测定VT噬菌体对不同菌株的敏感性。结果显示噬菌体在3种土质中的吸附能力不同，噬菌体能较好地吸附到粘土和壤土，但在砂土中的吸附力较差。在上述三种土质中，室温条件下 30d仍有一部分感染性的噬菌体粒子存在．M k土壤是 VT噬菌体存活的重要场所。噬菌体对不同菌株的敏感性不同，能使15株大肠杆菌中12株溶源或裂解，2株福氏痢疾杆菌溶源，但不能感染肠中的3株沙门氏菌，在溶源菌株中均检测到VTZ基因。可见VT噬菌体的感染具有宿主特异性，敏感菌由于获得了VT基因而增强了毒力。 VT噬菌体能感染多种宿主菌，简种属特异性，这种特异性与宿主菌表面的蛋白受体有关，噬菌体与特异性受体的结合是噬菌体感染的第一步。本试验对已克隆的但尚未明确功能的vpr基因进行了功能检测．利用含有卡那霉素抗性(Kan门基困的自杀性质粒 pJP5603和含 vpP全长基因的 pUC19phiOlllD质粒，分别采用粘性末端及平末端两种连接法。pJP5603用 Hn 11和 Xmal消化，回收 3kb的载体质粒，PUC中m用m。11和dg6I消化，回收778咖w目的基因。通过粘性末端连接，转化到感受态细菌 CClls人pir，利用 Kanr’进行筛选，获得的克隆经 ACC切鉴定和 PCR检测，确定得到重组质粒，RP pYYvp。将重组质粒的 DNA转化到含有全长叩r基因的感受态细胞 MC 06，筛选到的克隆经 PCR检测，得到一株克隆既扩增出 vpr基因，又扩增出 Kan’基困，进一步经 Southers blot狮，获得一个可靠的 MC1061的叩厂同源基因突变株，即MCm61 ovpr。该突变株与亲本MCm61具有相似的生长特征。噬菌体裂解试验表明，突变株对VTZ噬菌体C43b不敏感，而 MC1061敏感，表明 vpr基因与VTZ噬菌体的裂解敏感性有关。在获得 IW同源基因突变株 MC 06 IW的基础上，通过基因转化获得了突变株的回复株。并采用6－His标于己的方法；纯化了Vpr蛋白，制备了兔的抗VPr抗体。噬菌体裂解试验显示，回复株和亲本株对＊D噬菌体的裂解敏感，而突变株＊C106］a vpr能抵抗 VTZ噬菌体的裂解。噬菌体吸附细胞壁试验中；93％以上的噬菌体能与亲本MC 06和回复株MC1061c 的细胞壁不可逆性结合，但85．4o的噬菌体不能与突变株MC1061 Lw的细胞壁结合．在蛋白表达中，Western blot的结果显示，＠复株和亲本株均能转印出特异性 90 000主带，而突变株没有，因此可以确定分子量为90 000的 Vpr蛋白为 VTZ噬菌体的受体。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
第一篇文献综述  9-33
  第一章大肠杆菌0157:H7的毒力因子的研究进展  9-16
  第二章大肠杆菌0157的粘附素  16-23
  第三章噬菌体介导的毒力基因的转移  23-28
  第四章大肠杆菌基因多样性与噬菌体的关系  28-33
第二篇试验部分  33-87
  第五章牛肉中大肠杆菌0157的检测  33-39
    1 材料与方法  33-34
    2 结果  34-35
    3 讨论  35-37
    参考文献  37-39
  第六章大肠杆菌VT噬菌体的分离与溶源转染  39-50
    1 材料与方法  39-43
    2 结果  43-46
    3 讨论  46-47
    参考文献  47-50
  第七章 VT噬菌体的体外存活和基因传播特征  50-60
    1 材料与方法  50-53
    2 结果  53-56
    3 讨论  56-58
    参考文献  58-60
  第八章大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建  60-68
    1 材料与方法  61-62
    2 结果  62-64
    3 讨论  64-66
    参考文献  66-68
  第九章大肠杆菌VT噬菌体受体(vpr)基因突变株的构建及其特性  68-77
    1 材料与方法  69-70
    2 结果  70-73
    3 讨论  73-75
    参考文献  75-77
  第十章大肠杆菌vpr基因突变株的蛋白表达及功能研究  77-87
    1 材料与方法  77-80
    2 结果  80-83
    3 讨论  83-84
    参考文献  84-87
全文结论  87-88
致谢  88-89
附录  89

大肠杆菌VT噬菌体的特征及其受体研究

内容摘要

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