学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

FMLP刺激的HL-60中[Ca～(2+)]i和某些激酶对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用

作　者: 崔玉东
导　师: 殷震
学　校: 中国人民解放军军需大学
专　业: 预防兽医学
关键词: HL-60细胞 fMLP NADPH氧化酶胞浆Ca2+ 蛋白激酶C 磷脂酰肌醇3-激酶 p38丝分裂原活化蛋白激酶胞外信号调节激酶肌动蛋白聚合
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
下　载: 101次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

趋化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸（fMLP）能够诱导中性粒细胞发生多种生物学反应，包括NADPH氧化酶催化的过氧化物生成、游走、肌动蛋白聚合等。fMLP与中性粒细胞表面G蛋白偶联受体结合后，迅速引起磷脂酶C（PLC）激活，进而引起胞浆Ca²⁺浓度升高和激活蛋白激酶C（PKC）。PKC使NADPH氧化酶胞浆成分p47^phox发生磷酸化，并引起p47^phox和其它胞浆成分转位到胞浆膜上，与氧化酶膜成分一起形成完整的、有活性的NADPH氧化酶，产生过氧化物。在PKC激活的同时，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）也被激活，PI3-K进一步引起蛋白激酶B（PKB，或称Akt）激活，据研究认为Akt能够激活NADPH氧化酶，而且PI3-K还能够参与中性粒细胞的趋化作用。另外，有证据表明有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族的p38 MAPK和胞外信号调节激酶（ERK）也可能调节NADPH氧化酶激活和参与趋化作用。但是有关胞浆Ca²⁺和PKC、p38 MAPK、ERK、PI3-K激酶在NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合方面的作用以及有关胞浆Ca²⁺和这些激酶参与NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的信号转导途径仍不清楚。本研究应用胞浆Ca²⁺螯合剂和PKC、p38MAPK、ERK、PI3-K激酶抑制物研究了在中性粒细胞样HL-60细胞中这些信号分子对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用及某些相互关系，也研究了Ca²⁺螯合剂、PKC和PI3-K对fMLP诱导Akt激活的作用。为进一步了解和认识NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合机理及其信号转导途径、以便临床上更好地防治炎症及炎症性疾病奠定理论基础。首先，为确定胞浆Ca²⁺和这些激酶在NADPH氧化酶激活过程中的作用，使用不同剂量的Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM、PKC抑制剂GF109203x、p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK抑制剂PD098059和PI3-K抑制剂wortmannin处理细胞，然后检测了对过氧化物生成的影响。结果10μmol／L BAPTA-AM和8μmol／L GF109293x均明显地抑制过氧化物产生；50μ mol／L SB203580和50μ mol／LPD098059分别抑制50％和 60％过氧化物生成；0.1μmol／Lwortmannin仅抑制30％过氧化物生成。为了解O₂^-产生过程中PKC、p38MAPK、ERK和PI3-K激酶对胞浆Ca²⁺变化是否有调节作用，用激酶抑制剂处理细胞后检测了这几种激酶受到抑制时对utn刺激的胞浆cap变化的影响，结果这些激酶对胞浆cah浓度变化没有明显影响。为澄清胞浆 CaZ＼ PKC和＊－K对 p38MAPK、ERK和Akt激活的调节作用，用Ca‘”螫合剂和PKC、PI3＊抑制剂处理细胞后检测mLP诱导的 p3 8 MAPK、ERK和 Akt激酶活性，结果证实Ca卜、PKC和PI3－K对p38 MAPK激活均有一定的调节作用；而ERK和Akt主要受PI3－K调节。这些结果表明在fMLP诱导的HL60细胞中，胞浆Ca入”KC依赖性途径对NADPH氧化酶激活起着重要作用，而PI3－K依赖性途径包括ERK和Akt仅起到部分作用；这些激酶激活不影响n付＊P诱导的胞浆＊／”变化；ERK和 Akt主要受到 P13l调节，而p38 MAPK则受到胞浆C／”、PKC和N3．K共同调节而参与NADPH氧化酶激活。为了进一步了解 p3 8 MAPK激活 NADPH氧化酶的机理，用抑制物 SB203580研究了在分化的 HL巧0细胞内 p38 MAPK对fMLP诱导的 p47…叶磷酸化和转位到胞浆膜上的作用。结果发现p38 MAPK激活的动力学与NADPH氧化酶激活动力学一致，50u mol／L SB203580有够完全抑制 p38 MAPK激活，并能明显抑制p38 MAPK对 n47”‘”“体夕磷酸化和 n47”‘””转位至胞浆膜上。这些结果说明在 uLP刺激的分化为中性粒细胞样的 HL60细胞中 P3 8，v＆vx可能通过磷酸化p＃／加”和影响p4v则转位到胞膜一k而参与NADPH氧化酶激活。肌动蛋白聚合和解聚是中性粒细胞发生趋化作用和运动性的关键。为了解胞浆 Ca卜和 PKC、p3 8 MAPK、ERK、PI3＊这几种信号分子对肌动蛋白聚合的调节作用，用胞浆 ca》螫合剂和这些激酶抑制物处理分化的HL－60 细胞，然后用流式细胞仪检测fMLP刺激的肌动蛋白聚合。结果 0．in mol／L wortmannin明显地抑制了 fMLP诱导的肌动蛋白聚合，而 10 u mol／L BAPTA．AM、8u mol／L GF109293x、50 u mol／L SB203580和 50 u mol／L PD098059对fML诱导的肌动蛋白聚合均无明显影响。这些结果表明肌动蛋白聚合受到 PI3－K调节，而不受胞浆 Ca》和 PKC、p38 MAPK、ERK调节，而且PI3－K调节的肌动蛋白聚合信号转导途径不同于PI3。K调节 ERK和 P3 8 MAPK激活的信号转导途径。

全文目录

中文摘要  9-11
前言  11-13
第一部分：文献综述  13-53
  综述一中性粒细胞NADPH氧化酶的研究进展  13-25
    1 氧化酶各种成分的功能特性  14-18
    2 氧化酶亚基的磷酸化  18-20
    3 氧化酶亚基的蛋白质与蛋白质相互作用  20-23
    4 氧化酶的激活和慢性肉芽肿病  23-25
  综述二 FMLP诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活和运动性的信号转导过程  25-53
    1 中性粒细胞激活刺激物  25
    2 G-蛋白偶联受体  25-26
    3 参与FMLP诱导的中性粒细胞激活的各种主要成分  26-31
    4 FMLP诱导的NADPH氧化酶激活的信号转导途径  31-33
    5 中性粒细胞的趋化作用和运动性的信号转导途径  33-36
    6 展望  36
    7 参考文献  36-53
第二部分：研究内容  53-99
  试验一胞浆Ca~（2+）和某些激酶在NADPH氧化酶激活中的作用  53-75
    1．1 材料与方法  55-57
    1．2 结果  57-64
    1．3 讨论  64-67
    1．4 小结  67-68
    1．5 参考文献  68-75
  试验二 FMLP刺激的HL-60中P38 MAPK对NADPH氧化酶激活机理的研究  75-87
    2．1 材料与方法  76-79
    2．2 结果  79-82
    2．3 讨论  82-83
    2．4 小结  83
    2．5 参考文献  83-87
  试验三在fMLP刺激的HL-60细胞中PI3-K介导的肌动蛋白聚合  87-99
    3．1 材料与方法  88-89
    3．2 结果  89-91
    3．3 讨论  91-93
    3．4 小结  93-94
    3．5 参考文献  94-99
结论  99-101
致谢  101-103
个人简历  103-105
英文摘要  105-109

FMLP刺激的HL-60中[Ca～(2+)]i和某些激酶对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用

内容摘要

全文目录

相似论文