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禾谷镰刀菌蛋白激酶基因PUF1功能验证

作　者: 徐齐君
导　师: 胡小平；许金荣
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 禾谷镰刀菌蛋白激酶功能验证 PUF1
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)引起的一种真菌病害,主要发生在温暖、潮湿地区,是一种世界性的麦类病害(Bai and Shaner 2004)。小麦赤霉病菌能够产生多种单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes),该毒素可使人、畜中毒,不仅危害人、畜的健康,还严重影响小麦的品质及商业价值。小麦各生育阶段均能受害,引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐。生物体内普遍存在的信息转导调节方式是蛋白激酶(protein kinase,pk)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase)催化蛋白质磷酸化与去磷酸化,这一过程几乎涉及所有的生理及病理过程。本研究选取禾谷镰刀菌基因FGSG 04053,通过tblastn在genbank中比对发现它是丝状真菌中独一无二的激酶基因(Protein kinase Unique to Filamentous fungi),我们对它命名为PUF1。它在裂殖酵母中最同源的基因是Prp4,Prp4蛋白激酶是裂殖酵母mRNA前体完成剪切的必须因子。通过敲除禾谷镰刀菌FGSG 04053获得突变体来研究基因在禾谷镰刀菌生长、分化以及致病过程中的作用,结果如下：(1)本研究通过PEG介导原生质体转化的方法,并通过southern blot验证,得到3个PUF1基因缺失的突变体菌株。(2)PUF1基因缺失突变体菌株有严重的生长缺陷,与野生型菌株PH-1相比：菌落生长速度严重受限,没有气生菌丝,菌落生长一段时间还会突变,产生角变子(Sector).孢子产生量下降100倍；孢子形态畸形多样,从单孢到多孢；菌落边缘生长受限导致分枝短小浓密；突变体菌株接种小麦穗不致病,接种点小麦籽粒也不含赤霉菌毒素。可见PUF1基因对病原菌的正常生长起重要作用。(3)通过构建互补载体PUF1-PHZ100,并转化突变体菌株,经PCR检测,得到5个回复突变菌株,互补转化子的表型与野生型PH-1基本一致。(4)通过构建PUF1-GFP融合载体,原生质体转化野生型菌株PH-1,得到6株PUF1-GFP融合载体成功转化的菌株,通过荧光显微镜观察PUF1-GFP融合蛋白的表达及DAPI细胞核染色确证：PUF1基因在细胞核内表达,这与裂殖酵母同源基因Prp4的功能表达是一样的,Prp4就是在细胞核内剪切mRNA的,推测PUF1基因与病原菌RNA加工过程有关。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-21
  1.1 小麦赤霉病概况  12-13
  1.2 禾谷镰刀菌概况  13-16
    1.2.1 禾谷镰刀菌基本生物学特性概述  13-14
    1.2.2 禾谷镰刀菌基因功能研究概述  14-16
  1.3 蛋白激酶研究概况  16-20
    1.3.1 激酶基因概述  16-17
    1.3.2 主要的蛋白激酶介绍  17-18
    1.3.3 本研究有关的基因研究进展  18-20
  1.4 本研究的目的意义和技术路线  20-21
第二章禾谷镰刀菌FGSG_04053基因敲除和突变体的验证  21-34
  2.1 实验材料、仪器、试剂和培养基  21-22
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验仪器  21-22
  2.2 试验方法  22-29
    2.2.1 禾谷镰刀菌Puf1基因序列分析  22
    2.2.2 引物设计  22-23
    2.2.3 CTAB法提取基因组DNA  23
    2.2.4 大肠杆菌DH1OB感受态制备  23-24
    2.2.5 质粒PCB1003的提取  24
    2.2.6 重叠PCR和split PCR  24-25
    2.2.7 琼脂糖凝胶DNA回收  25
    2.2.8 PCR产物浓缩  25-26
    2.2.9 制备原生质体及PEG介导转化  26
    2.2.10 快速提取转化子DNA  26-27
    2.2.11 PCR检测转化子  27
    2.2.12 Southern blot验证突变体  27-29
  2.3 实验结果与分析  29-33
    2.3.1 FGSG_04053基因序列分析  29-30
    2.3.2 基因敲除引物设计  30-32
    2.3.3 Southern blot验证结果  32-33
  2.4 讨论  33-34
第三章 PUF1基因缺失突变体表型分析  34-40
  3.1 实验材料、仪器耗材和培养基  34
  3.2 实验方法  34-35
    3.2.1 菌落形态观察和生长速率测定  34
    3.2.2 产孢量测定和孢子形态观察  34
    3.2.3 孢子萌发观察  34
    3.2.4 菌落边缘形态观察  34
    3.2.5 有性杂交实验  34-35
    3.2.6 小麦穗侵染  35
  3.3 结果与分析  35-39
    3.3.1 菌落形态观察和生长速率  35-36
    3.3.2 孢子形态、产孢量和孢子萌发  36-37
    3.3.3 突变体菌落边缘观察  37-38
    3.3.4 突变体有性不育  38
    3.3.5 小麦穗侵染分析  38-39
  3.4 讨论  39-40
第四章 PUF1基因功能回复验证  40-45
  4.1 材料、试剂和仪器  40
    4.1.1 实验材料  40
    4.1.2 试剂和仪器  40
  4.2 实验方法  40-43
    4.2.1 互补引物设计  40-42
    4.2.2 互补载体构建  42-43
    4.2.3 互补载体PUF1-PHZ100转化突变体菌株M15  43
    4.2.4 互补转化子的筛选  43
    4.2.5 互补转化子表型分析  43
  4.3 结果与分析  43-44
    4.3.1 互补载体PUF1-PHZ100的构建  43
    4.3.2 互补转化子的获得  43-44
    4.3.3 互补转化子表型分析  44
  4.4 讨论  44-45
第五章 PUF1基因亚细胞定位  45-50
  5.1 实验材料、试剂和仪器  45
  5.2 实验方法  45-48
    5.2.1 引物设计  45-46
    5.2.2 亚细胞定位载体构建  46-48
  5.3 结果与分析  48-49
    5.3.1 亚细胞定位载体的构建  48
    5.3.2 荧光显微镜检测基因表达部位  48-49
  5.4 讨论  49-50
第六章角变子DNA测序验证自发突变  50-53
  6.1 材料、仪器和试剂  50
  6.2 试验方法  50-51
    6.2.1 分析与PUF1基因互作的基因并下载序列和设计引物  50
    6.2.2 角变子DNA提取和基因片段扩增  50
    6.2.3 角变子测序  50
    6.2.4 角变子序列比对  50-51
  6.3 结果  51-52
    6.3.1 引物设计  51
    6.3.2 角变子测序结果  51-52
  6.4 讨论  52-53
第七章结论  53-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
作者简介  60

禾谷镰刀菌蛋白激酶基因PUF1功能验证

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